肿瘤冷冻治疗学|氩氦刀冷冻疗法

临床陆续有报道，某些肿瘤如前列腺癌、口腔癌、直肠癌、恶性黑色素瘤和乳腺癌，冷冻治疗后出现免疫反应，转移性病灶消散或得到遏制
实验研究显示，冷冻治疗后机体产生抗肿瘤抗体；冷冻原发肿瘤可遏制继发性肿瘤生长及转移
被冷冻的实验肿瘤，残存的病灶周围有反应性肉芽形成，有新生毛细血管，富含肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、浆细胞、单核细胞和巨噬细胞等。此种肉芽组织由抗癌性间质反应而形成，具有抗肿瘤免疫的特征
肿瘤冷冻治疗后免疫反应加强可能由于（1）肿瘤抗原的激发及暴露，细胞表面抗原发生质和量的变化，包括细胞表面膜蛋白的浓度增加，细胞表面蛋白组分变得较均质化，高分子膜蛋白去聚合化或裂解为小分子膜蛋白，后者能增加膜蛋白末端序列抗原决定簇的浓度，去除抗原决定簇的空间障碍而增加抗原的利用度；（2）抗肿瘤性细胞毒性抗体产生；（3）诱发细胞毒性T细胞免疫
免疫调剂剂可强化冷免疫功能。有证据表明，蛋白结合多糖制剂，可强化冷免疫功能，抑制残余肿瘤生长。多糖类制剂可明显减少冷冻后白介素（IL）－4和IL－10的产生，促进TNF-α与IFN-γ的生成及增强脾细胞的T细胞毒活性。
A number of clinical reports suggested induction or stimulation of tumor-specific immune reaction, and the reduction or disappearance of metastatic disease after cryo-destruction of the primary tumors, such as prostate cancer, cancer of oral cavity, rectal cancer, melanoma and breast cancer
The immune modulating effect of cryosurgery was evaluated in several animal models. Cryoablation of tumor tissue can result in a systemic antitumor immune reaction production and inhibition of secondary of metastatic tumor growth
There is histological verification of cryoimmunologic reaction. The tumor residue following freezing is circumscribed by reactive granulation, rich in cells and newly grown capillaries. Cell components of these areas consist mainly of ‘tumor infiltrating lymphocytes (TIL)’, plasma cells, monocytes, and macrophages. This granulation tissue results from the interstitial reaction against cancer, and this phenomena can be interpreted as a manifestation of the antitumor immunity.
Immune enhancement or activation after cryosurgery is probably due to the following possible mechanisms:(a) a quantitative and qualitative change in the surface antigen (component) of tumor cells, for example, absolute increase of surface protein concentrations of tumor cells, change of cell-surface protein pattern from heterogeneous to relatively more homogeneous, and depolymerization and breaking of higher-molecular-weight components which increase the concentration of terminal-sequence antigenic determinants and increase accessibility of determinant grouping by removing steric hindrance following freezing；(b)production of an antitumor antibody； (c) inducing an immunostimulatory signal that creates a T-cell response to the tumor
Combining cryoablation with administration of the polysaccharide preparation is helpful in the prevention of growth of residual tumors. The protein-bound polysaccharide treatment significantly reduced the production of IL-4 and IL-10 following cryoablation; the production of TNF-a and INF-c was slightly promoted; the natural killer and cytotoxic T-cell activities of splenocytes were slightly enhanced

冷冻治疗不仅可用于局部消融肿瘤，而且可通过激发或强化抗肿瘤免疫反应，遏制其他部位的或转移性病灶。这一机制在临床观察与实验研究中均得以证实。

临床观察

1980年以来，陆续有报告前列腺癌、口腔癌、直肠癌和乳腺癌冷冻治疗后出现免疫反应[1-4]。前列腺癌冷冻治疗，可观察到转移性病灶的消散。转移性肺癌经冷消融治疗后，转移可得到遏制。类似现象也见于转移性肝癌和恶性黑色素瘤。Suzuki[4]报告8例Ⅳ期乳癌患者，其原发性肿瘤接冷消融后，8例中2例的远处转移（包括区域淋巴结、对侧转移和胸膜渗液）消失。在其他类型肿瘤冷冻治疗后也观察到类似情况。

Tanaka[5]报告10例黑色素瘤接受冷冻治疗后，4例（Ⅰ期～Ⅳ期）长期生存，无复发与转移，其中2例生存长达20年以上。有一例患者，76岁，女性，上腭部黑色素瘤Ⅲ期o将肿瘤的大部分予以冷冻。1年后，上腭与口咽部残存的黑色斑块相继自发性消失。13个月后，给予双侧颈部淋巴清扫。共摘除20个淋巴结，大多数呈黑色，但未见转移。此后2年内病人无复发生存。另一例 71岁，男性，左足底Ⅲ期黑色素瘤，PT4bpN0M0o主要肿瘤大小为20mm×10mm,浸润范围45mm×30mm，伴多发性卫星病变。主要病灶冷冻治疗后，卫星灶相继消失。病人无病生存8年，左下肢也得以保留（参见“7.2 黑色素瘤”）。

笔者所在医院近5年来应用冷冻治疗多种肿瘤2500多例，其中有6例原发肿瘤冷冻后，残存病灶或转移瘤相继消失或长期稳定。

例1　男性，46岁。5年前因升结肠癌接受手术切除治疗。术后病理检查：T2N1M0。2年后查CT见右肝有5cm×6cm占位性病变，左叶邻近胆囊处有二枚占位性病灶，大小分别为1cm×1.5cm和2.0cm×2.1cm。血清CEA 为392μg/L。肝活检显示结肠癌肝转移。给予右肝肿瘤氩氦冷冻治疗。术后1个月复查CEA为210μg/L，3个月后复查CT，显示右肝原病灶缩小至4.4cm×3.8cm，左肝两处占位性病灶无变化；6个月后复查CEA为21μg/L，右肝病变缩小至1.4cm×0.8cm，左肝近胆囊处病灶消失。右肝原病灶处活检显示为纤维化组织。患者生存至今已3年8个月。

例2 女性，41岁。胸痛半个月，CT检查：右肺肿瘤，伴脑转移。活检显示为腺癌。给予化疗3个疗程，无反应。CT引导下作经皮肺癌冷冻治疗。患者拒绝接受脑放射治疗。3个月后复查，肺部肿瘤大部消失，活检呈纤维化改变；脑肿瘤消失 (图 2.3-1)。患者生存37个月，后死于疾病复发。

        A                                       B                               C                               D
        图 2.3-1 肺癌伴脑转移冷冻治疗前后CT表现
         A．右肺块状病灶，正在作冷冻治疗；B．冷冻前左脑内占位性转移灶；C．冷冻治疗后3个月，右肺病灶明显缩小；D．肺部冷冻后3个月，脑转移灶消失

例3 男性，66岁。右足根部黑色素瘤，给予手术切除。7个月后右足部肿瘤复发，鸡蛋大小，伴右侧腹股沟多个淋巴结肿大，透过皮肤可见呈黑色，活检显示黑色素瘤转移。给予足部肿瘤冷冻治疗。一个月后，右侧腹股沟淋巴结不能扪及。10个月后随访，未见复发。

例4 女，36岁。女性，42岁。左侧乳腺肿块，逐渐增大13个月，近2个月下身麻痹不能行走。检查发现左侧乳房内6 х 6 cm大小肿块，质硬；双侧下肢不全性瘫痪。左乳腺肿块活检显示为浸润性导管腺癌。左腋下淋巴结肿大。X线片和CT显示胸腰椎多处骨转移。仅给予左乳腺肿瘤和腋下淋巴结经皮冷冻治疗。2个月后，下肢瘫痪改善，并逐步能行走。12个月后复查，左乳腺肿瘤明显缩小；35个月后复查，患者全身情况良好，PET-CT显示乳腺和腋下未见肿瘤残余和复发，胸腰椎多发骨质破坏，代谢活性不增高，提示肿瘤活性受抑（图2.3-2）。

        A                                    B                               C
        图 2.3-2 乳腺癌冷冻治疗前后影像学表现
        A．冷冻治疗前乳腺癌外观；B.治疗前MRI显示多发性脊柱骨转移；C.冷冻治疗后35个月PET-CT 显示乳腺肿瘤无残余和复发，胸腰椎多发性骨质破坏，但代谢活性无增强

实验研究

许多实验研究显示冷冻可促进机体抗肿瘤免疫，但也有报道冷冻对免疫无影响甚至抑制免疫。复习13篇文献[6～18]，7篇显示阳性结果（冷冻促进免疫，抑制转移），各有3篇分别显示中性（无影响）和负性（抑制）结果（表2.3-1）。实验结果不尽一致，可能与采用的实验模型和条件不同有关。
Yantorno[19]和Shulman[20]首先在动物实验中，显示冷冻后产生抗器官特异性和种属特异性抗体；Blackwood等[21]在动物肿瘤模型发现冷冻后产生抗肿瘤抗体；Ablin等[22]应用免疫荧光技术检测到能与前列腺组织起反应的抗体；Mochizuki[23]将冷免疫淋巴细胞输注给其他动物，发现肿瘤特异性免疫可以转移，产生被动抗肿瘤免疫。

表2.3-1 冷冻治疗后免疫反应的实验研究

模型系统（诱导物）	处理	研究结果
乳腺腺癌（病毒）[6]	冷冻	与手术切除相比，冷冻后对继发性肿瘤抵抗力增强
乳腺腺癌（病毒）和原发性纤维肉瘤（化学性）[7]	冷冻	肿瘤转移减少，如冷冻后4～24小时将坏死组织切除，转移更少
R3327前列腺腺癌（遗传性）[8]	冷冻/BCG注射	对继发性肿瘤呈排斥反应
Dunn骨源性肉瘤（遗传性）[9]	冷冻	冷冻抑制抗体与自然杀伤细胞（NK）的免疫反应，但肿瘤转移发生率降低
MRMT-1乳腺腺癌（化学性）[10]	冷冻	冷冻增加免疫细胞有丝分裂，促进一种可能的免疫反应
HSV-2诱导的纤维肉瘤[11]	冷冻	冷冻后NK细胞被激发
R3327前列腺腺癌（遗传性）[12]	冷冻	白细胞活性轻度增加，肿瘤生长速率轻度降低
MRMT-1乳腺腺癌（化学性）[13]	冷冻	冷冻组和手术组肿瘤转移无差异，但冷冻组肿瘤细胞生长抑制
MRMT-1乳腺腺癌（化学性）[14]	冷冻	冷冻后1～3周肿瘤免疫受抑，但7～10周时出现抗肿瘤免疫
MRMT-1乳腺腺癌[15]	冷冻	冷冻后3周对肿瘤的抵抗性降低，但至10周时抵抗性升高，淋巴细胞计数与有丝分裂活性呈现相应改变
原发性纤维肉瘤（化学性）[16]	冷冻	与手术相比，冷冻后肿瘤抵抗性降低
KHT-17纤维肉瘤（化学性）[17]	冷冻	与手术相比，冷冻后肿瘤免疫降低，转移增加
LDC11-S纤维肉瘤（病毒性）[18]	冷冻	冷冻后免疫抑制细胞被激活

Urano等[24]用脾内注射法制作鼠实验性转移性肝肿瘤模型，然后用液氮接触法对肝内部分肿瘤进行冷冻，发现与未冷冻的对照组相比，冷冻组肝内转移少，脾注射处原发肿瘤也小。Allen 等[25]给实验组鼠肝包膜下植入1mm3肝肿瘤片，制造实验性肝肿瘤。两周后，将实验动物分为两组：一组给予30%肝切除，一组给予肿瘤冷消融。另有对照组，无肿瘤，仅给予剖腹治疗。所有鼠在治疗后立即从门静脉内注入肿瘤细胞，观察肝内肿瘤生长情况。结果发现，对照组与冷冻组肝内肿瘤结节数无明显差异，但均明显少于手术切除组。切除组40%的动物，肝全被肿瘤占据，而在冷冻组与对照组无一只动物的肝被肿瘤全部占据(图2.3-3)。切除组血清碱性纤维生长因子升高，而在冷冻组与对照组则否。

         图2.3-3 实验鼠第二次输注肿瘤细胞后肝内肿瘤生长状况
        （引自Allen PJ，et al．Am Surg Res， 1998，77：132～136）
        A．对照鼠；B．冷冻组；C．手术切除组

Sabel等[26]给实验鼠右侧腹部皮下接种乳癌细胞，11天后，皮下出现可触及性肿瘤，给予手术切除或冷冻治疗。2周后，给所有鼠左侧腹部再植入乳癌细胞，10天后，观察左侧腹部肿瘤生长情况，发现手术切除组7只鼠中6只有肿瘤生长，而在冷冻组4只鼠中仅1只有肿瘤生长。

Joosten等[27]通过实验研究发现冷冻一处肿瘤可抑制另一处肿瘤生长。大鼠两处皮下植入非免疫性鼠结肠肿瘤细胞系（Colon26-B）细胞，一处在鼠腿部，一处在鼠侧腹部，制造实验性移植瘤模型。7天后，对腿部移植瘤予以冷冻或切除，然后观察未治疗的侧腹部肿瘤的生长情况。结果显示，冷冻组侧腹部肿瘤生长明显抑制，而切除组未产生类似结果。冷冻正常组织无类似作用（图2.3-4）。应用裸鼠模型作类似实验，也显示冷冻一处肿瘤可引起第二处肿瘤生长抑制。为了研究冷冻对自发性转移的作用，将具有高度转移特性的MV3细胞系细胞植入裸鼠股部，制造实验性肿瘤，7天后，给予冷冻或手术切除。35天后，处死鼠，观察肺转移情况。在未治疗的对照组7只鼠中，6只出现肺部微转移，切除组10只鼠中8只出现肺转移，而冷冻组11只鼠中仅3只出现肺转移，且冷冻组转移灶明显小于未治疗对照组与切除组（表2.3-2）。

        图2.3-4 鼠模型腿部肿瘤冷冻或切除后腹部肿瘤生长曲线
        （引自Joosten J．A，etal．Cryobiopsy 2001，41：49～58）
         腹部肿瘤的大小在冷冻组与切除组之间，以及冷冻组与切除+冷冻正常组织组鼠之间，具有统计学差异（XＰ<0.05 和 XXＰ<0.01）

冷免疫反应在组织学上也得到证明[28]：给兔背部两侧皮下接种Vx2癌细胞，右背植入5×106细胞，左背植入1×106细胞。将右侧肿瘤进行冷冻循环（-120℃），作3个轮回冷冻-复温，对左侧肿瘤不予处理。冷冻后17天作组织学检查。结果显示：（１）未冷冻处理的对照组兔左背肿瘤浸润至皮肤内（图2.3-5A）；（２）冷冻组兔右背肿瘤消失，皮下脂肪组织坏死（图2.3-5B），左背肿瘤也显示中心性坏死与液化，残存肿瘤周围有反应性肉芽形成，有新生毛细血管，富含肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、浆细胞、单核细胞和巨噬细胞等（图2.3-5C）。这种肉芽组织由抗癌性间质反应而形成，具有抗肿瘤免疫的特征（图2.3-5D）。

        A                                    B                        C                                D
        图2.3-5 冷免疫反应的组织学证据
        （引自Tanaka S， et al． in： Korpan NN． Ed．Basics of Cryosurgery．WeinNewYork：Springer-Verlag．2001：31～37）
         A.对照组兔真皮内见浸润性癌细胞；B.右侧背部肿瘤给予冷冻，17天后肿瘤坏死，无瘤细胞存在；C.右侧背部肿瘤冷冻后17天，左侧肿瘤自行退缩，中心区坏死和液化，残存肿瘤周围出现富含细胞的反应性肉芽组织包膜和新生毛细血管（HE×50）；D．临近肿瘤的肉芽组织内有明显淋巴样增生

冷冻治疗启动抗肿瘤免疫反应的机制尚不明，冷冻诱发的特异性或非特异性抗肿瘤反应，均可能在其中起重要作用。

肿瘤细胞冷冻后，其细胞表面抗原会发生质和量的变化。正常细胞膜由半液态双层磷脂和与之相附着的两种蛋白（周围型蛋白与整合蛋白）组成。在生理温度下，大部分膜处于溶胶相，即液晶相。冷冻后，细胞膜发生下列改变：（１）脂质双层发生期相转化，从无序的液态（液晶状态）突然变为高度有序的六角形脂肪链晶阵态（凝胶状态）；（２）膜脂质流动性增强，整合膜蛋白向侧方（或旋转）弥散；（３）冷冻后细胞皱缩，膜蛋白垂直移位，穿过膜外泄；（４）蛋白变性、伸展，不能再聚集；（５）周围型蛋白与整合蛋白呈高亲和力结合，特别是与从表面向外突出的非跨越蛋白结合。

Roy等[29]观察了腹水纤维肉瘤细胞的膜周围型蛋白，发现冷冻处理后，此种蛋白明显增加，其中大分子膜蛋白减少，而小分子量膜蛋白显著增加，这与天然细胞膜主要含有大分子膜蛋白相反。电泳分析显示，冷冻处理的细胞膜蛋白组分远较天然细胞为少。由此推测，肿瘤冷冻治疗后免疫反应加强可能由于下列原因：（1）瘤细胞表面膜蛋白的浓度增加；（2）细胞表面蛋白组分变得较均质化；（3）高分子膜蛋白去聚合化或裂解为小分子膜蛋白，后者能增加膜蛋白末端序列抗原决定簇的浓度；（4）去除抗原决定簇的空间障碍而增加抗原的利用度。

在清除原发肿瘤冷冻坏死性碎片的过程中，吞噬细胞提呈的抗原诱发机体产生抗肿瘤抗体，如抗肿瘤特异性膜蛋白的抗体。这些抗体与活存的肿瘤细胞表面膜蛋白结合，并诱导补体结合及巨噬细胞、中性粒细胞的化学趋向反应，造成对肿瘤细胞的毒性环境。这些抗体常称为细胞毒性抗体。临床上发现前列腺癌冷冻治疗后血清总抗体与抗前列腺抗体水平增高。Ravindranath等[30]研究发现结直肠癌肝转移冷冻治疗后，血清抗癌相关性神经节苷抗体升高，射频或手术治疗后无此种反应。

冷冻治疗引发的抗肿瘤免疫中，细胞免疫可能起重要作用。主要有下列实验证据：
（1）Eskandari等[12]在荷遗传性R3327肿瘤实验动物，发现冷冻治疗后2周T细胞活性较冷冻前明显增加。T细胞活性与肿瘤生长呈负相关。

（2）肿瘤冷冻治疗后，可观察到区域淋巴结的形态学发生改变[31],细胞毒活性和/或淋巴细胞亚群测定显示特异性抗肿瘤免疫增强[32]。

（3）冷冻治疗后，与细胞免疫有关的细胞因子明显升高。Bayjoo等[33]发现大鼠正常肝和移植性肝肿瘤内NK活性在冷冻治疗后明显升高，而在非冷冻治疗的对照组无明显改变。Urano等[24]发现鼠实验性转移性肝肿瘤冷冻后，脾细胞产生的γ-肿瘤坏死因子（TNF-γ）、γ-干扰素（IFN-γ）和白介素（IL）-4和IL-10明显增加；NK和细胞毒性T细胞活性轻度升高。Joosten 等[27]也在鼠肿瘤模型发现冷冻治疗后6小时，血浆IL-lα和TNF-α水平在冷冻组明显高于切除组，而未处理的对照鼠血浆中测不出这两种细胞因子(表2.3-2)。这些细胞因子增加可能是肿瘤生长抑制的因素之一。

表2.3 -2 大鼠实验性腿部肿瘤处理后6 小时和48小时血浆细胞因子水平
（引自Joosten J，et al．Cryobiopsy 2001；41：49～58）

Sabel等[34]测定了实验性乳癌鼠冷冻治疗后血清Th1和Th2细胞因子水平，发现24小时后IL-12和TNF-γ明显高于手术切除鼠（图2.3-6）。这些结果提示冷冻可促进这些炎症性细胞因子参与细胞免疫。因为这两种因子均能促进NK细胞扩增和活性，虽然NK细胞对肿瘤并非特异性，但有一亚型即NKT细胞，表达NK细胞和T细胞受体，显示抗原特异性，可能具有抗肿瘤作用。

Sabel 等[34]还发现实验性乳癌模型鼠接受冷冻的肿瘤引流淋巴结内，出现肿瘤特异性T细胞反应，表现为对乳癌细胞（MT-901）的IFN-γ释放反应，而对肺癌细胞（line-1）无此反应（图2.3-7）。但这种反应不出现于脾脏内，说明仅限于肿瘤局部。这种反应也不会出现于接受过手术切除的鼠。

        图2.3-6 实验性乳癌鼠接受冷冻或手术切除后血清细胞因子水平
        （引自Sabel MS，et al．Breast Cancer Res Treat， 2005，90：97～104）
        治疗后24小时取血检测。IL-12冷冻组383.6pg/ml±32.8,手术组251.6 pg/ml±16.5,p=0.025；IFN-γ冷冻组1564 pg/ml±49,手术组1244 pg/ml±101, p=0.009 ；IL-4和IL-10在两组之间无差异性

        图2.3-7 鼠乳癌接受冷冻或切除后引流淋巴结内淋巴细胞对癌细胞的反应
        （引自Sabel MS，et al．Breast Cancer Res Treat 2005；90：97～104）
        采取肿瘤引流淋巴结，取淋巴细胞与MT-901（乳癌细胞）或Line-1（肺癌细胞）共培养，测定上清液中IFN-γ

（4）临床研究显示，肝癌患者冷冻治疗后，外周血NK细胞、IL-2/SIL-2R（可溶性白介素-2受体）升高，肿瘤内或瘤周淋巴细胞增多（表2.3-3，表2.3-4）[35]。

在临床上如何将上述研究结果应用于肿瘤治疗，是最受关切的课题。目前看来，冷冻对肿瘤具有两方面作用：局部的和全身的。前者指直接将肿瘤消融或破坏肿瘤后将其切除；后者指激发机体抗肿瘤免疫反应。利用后一种作用，在肿瘤治疗上，可采取一种新策略，即将主要肿瘤予以冷冻消融，让患者“带瘤生存”。这在一些多发性肿瘤或已有播散转移者，具有十分重要的意义。

如何强化冷冻后出现的抗肿瘤免疫，是另一需研究的课题。有研究表明，给予一些免疫调剂剂如蛋白结合多糖制剂，可强化冷免疫功能，抑制残余肿瘤生长。给实验鼠皮下植入肉瘤细胞，7天后，用冷冻破坏已形成的肿瘤。冷冻前到冷冻后10天内给予腹腔内注射一些“免疫强化剂”。7天后，再给予肉瘤细胞腹腔内注射，观察鼠生存情况。结果显示EA6（一种从菇类Flammulma velutipes提取的蛋白结合多糖）可明显延长鼠存活期。给予EA6口服也有类似作用。

多糖类制剂可明显减少冷冻治疗后IL-4与IL-10的产生，促进TNF-α与IFN-γ的生成及增强脾细胞T细胞毒活性。

Tanaka[28]列举一例67岁女性，患双侧进展型乳腺癌，溃疡面不断出血（图2.３-8A），TNM无法确定，活检示硬化型导管腺癌。鉴于病人全身情况差，不可能进行放/化疗，仅用冷冻作为姑息治疗。冷冻治疗后，肿瘤逐步消除，病人全身情况也明显改善。后作双侧乳房肿块切除及腋窝淋巴结清扫。左锁骨上与颈部淋巴结自发性消失。1周后，给予FEH-G（一种从Flammulina velutipes Sing提取的制剂）免疫治疗。2个月后，原手术处移植皮片的右侧缘出现小的结节（图2.３-8B），但不增大，给予手术切除。对切除标本作免疫组化染色，显示Ki67在治疗前阳性（图2.３-8 C），治疗后转为阴性（图2.３-9 D），提示肿瘤内无活化的增生细胞；p53和Bcl-2表达阴性；雌激素受体在免疫治疗结束时也转为阴性；孕激素受体始终阴性。上述结果说明肿瘤生长至少在局部被控制。由于激素受体阴性，内分泌治疗不可能有效，因此作者认为本例的治疗效果很可能是冷免疫强化所致。

临床上采用的各种免疫治疗，如细胞因子（干扰素、肿瘤坏死因子、胸腺肽、白细胞介素-2）、过继免疫（淋巴因子激活的杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、树突状细胞等），常应用于包括冷冻治疗在内的肿瘤综合治疗中，在某些患者有一定效果。这些措施与冻治疗之间的关系值得进一步研究。

        A                                    B                        C                             D
        图2.3-8 进展性双侧乳腺癌冷冻治疗与免疫调节剂治疗后经过
        （引自Tanaka S，et al．in：Korpan NN．Ed．Basics of Cryosurgery．WeinNewYork：Springer-Verlag．2001：31～37）
         A．治疗前，左侧肿瘤出现溃疡出血；B．反复冷冻治疗后给予皮瓣移植。右侧缘见小的局灶性复发病灶；C．治疗前Ki67染色阳性；D．免疫治疗后Ki67染色阴性

冷冻治疗肿瘤能促发人体抗肿瘤免疫，已为临床观察和实验研究所证实。将主要（原发性）肿瘤冷冻消融后，其他同样（或转移）肿瘤可消失或长期稳定；实验动物的一处肿瘤冷冻，另一处肿瘤也缩小或消失；与手术切除相比，冷冻治疗可使实验动物癌转移明显减少。抗肿瘤免疫的机制可能为冷冻后肿瘤抗原暴露、整合或其抗原性增强，促发机体产生体液免疫与细胞免疫，尤其是细胞毒性细胞免疫，可能起重要作用。冷冻免疫已成为当前研究的热点，如能从技术和理论上进一步探索，也许有可能改变未来肿瘤治疗的格局。