- 组织冷冻后被破坏的机制有两种：立即的和延迟的。组织立即损伤是冷冻和复温对细胞的直接损伤作用；延迟损伤则由微循环进行性衰竭所致
- 冷冻的直接损伤作用可用两阶段学说解释：冷冻初期（温度－4℃～－21℃），细胞外冰晶形成，引起细胞内渗透压上升，细胞内脱水。失去水分的细胞变得皱缩，细胞膜和细胞器因此而受损。当冷冻速度极快，温度进一步降低时，可引起第二阶段细胞损伤：细胞内冰晶形成。细胞器如线粒体和内质网因此而发生不可逆性损伤，继之细胞膜也损伤，最后导致细胞死亡
- 复温过程中，有两种机制引起靶细胞进一步损伤：（1）细胞内小冰晶再结晶或相互融合，形成大冰晶，后者对细胞有更强的破坏作用；（2）细胞外间隙冰晶溶解，成为低渗状态，水再进入细胞内，引起细胞肿胀，导致细胞膜破坏
- 冷冻导致血管收缩，血流减缓，血小板凝集，微血栓形成，最终血流淤滞，组织缺血缺氧，引起靶细胞损伤
- 在立即性冷冻损伤过程中，易溶性结晶体形成起着重要作用。易溶性结晶体十分细小，充填于细胞外冰晶与细胞膜之间的间隙，直接损伤细胞膜，引起细胞膜的破裂，进而导致细胞内易溶性结晶体形成
- 在亚低温下，冷冻主要引起靶细胞凋亡
- Cryosurgery destroys tumors by freezing and thawing them. Cryosurgery destructive effects on tumors are due to two major mechanisms, one immediate, the other delayed. The immediate mechanism is the damaging effect of freezing and thawing the cells. The delayed mechanism is the progressive failure of microcirculation; ultimately, vascular stasis becomes operative as an important cause of tumor tissue destruction
- Once the temperature falls into the freezing range, water is crystallized, which has more serious consequences than the earlier cooling. The effect of freezing on cells is based on ice crystal formation, the size and effect of which are related to the temperature achieved and to the rate of freezing, and the number of freeze thaw cycles. At around －15℃, ice crystals begin to form, initially in the extracellular spaces. As ice crystals form from pure water the extracellular spaces become hypertonic relative to the cell interior, a net movement of water from the intracellular to the extracellular space occurs, causing intracellular shrinkage and increasing intracellular solute concentration
- This osmotic gradient precipitates a diffusion gradient between the extracellular and intracellular spaces, which can influence the ionic concentration within the cell due to the net movement of H+ ions out of the cell, and the migration of solute ions into the cell. Saline concentrations greater than 2 moles per liter are damaging to most cellular proteins. A reduction of the intracellular pH to a value of 4 or below will cause further damage impairing enzyme systems and affect the lipoprotein components of the plasma membrane containing the cell and its organelles. This biochemical effect possibly has more destructive consequences than the physical effects
- With further cooling, ice crystals may form within the cells. The cell membrane has been considered a barrier to ice nucleation, but ice crystals may enter the cell through membrane injuries or perhaps through micropores. Once ice crystals form within the cell, cell death is almost certain
- During thawing, there are two factors that induce a greater destruction of targeting tissue：（a）the recrystallization or fusion of small ice crystals? form large crystals which is of more destructive feature；（b）the extracellular compartment becomes briefly hypotonic. Water reenters the cell causing cell swelling, and possibly cell membrane rupture
- Progressive failure of the microcirculation occurs due to a cascade of events: endothelial layer destruction causing vessel walls to become porous, interstitial edema, platelet aggregation, microthrombii, and ultimately vascular congestion and obliteration
- Continuous intracellular cooling eventually reaches the eutectic temperature immediately below which the remaining solvent and solute crystallize simultaneously. Two possible injury mechanisms are anticipated: (a) mechanical damage to the cell membrane due to eutectic crystallization, and (b) intracellular eutectic formation (IEF). The proposed mechanisms provide a more comprehensive physical explanation of freezing induced cell injury and extend the understanding on solution effects
- Under sub-hypothermia status，apoptosis is a main form of cell death
细胞如被冷冻至-10℃，所受损伤甚微，因为细胞内，主要是细胞质，能自动地防御冷冻的作用；一旦冷冻温度降至－30℃以下，细胞则死亡。不同类型的组织对冷冻的抵抗力不一，一般可将组织分为冷冻抗性（cryoresistant）和冷冻敏感性（cryosensitive）。组织对冷冻的敏感性与其所含自由水有直接关系。黏膜、皮肤、神经纤维和肉芽组织为冷冻敏感性组织，而结缔组织、纤维组织、脂肪和骨对冷冻具有抗性，能较长时间抵御较冷环境。
对于冷冻损伤的真正机制，目前尚不完全清楚，有两种学说：即细胞内/外冰晶形成和易溶性结晶形成。凋亡对亚低温下靶细胞破坏发挥作用。
冰晶形成学说
冷冻破坏靶组织的方式有两种：立即的和延迟的。组织立即损伤是冷冻和复温对细胞的直接作用；而延迟损伤是微循环进行性衰竭所致。血管内血流淤滞最终成为组织损伤的重要因素。
立即性冷损伤
冷冻后可发生下列两阶段改变：
第一阶段：即冷冻初期，细胞外冰晶形成，即“溶液效应”（solution effect），是冷冻（温度－4℃～－21℃）初期引起细胞死亡的主要机制。细胞外冰晶形成并逐渐增多，引起细胞外溶质浓度增大，产生高渗环境。由于细胞膜对冷冻具有屏障作用，因此初期虽然细胞内已处于超冷环境中，但尚未结冰。为了平衡化学渗透压，细胞内的水分便通过渗透压梯度作用渗透到细胞外间隙，从而引起细胞内渗透压上升，溶质浓度增加，细胞内脱水。失去水分的细胞变得皱缩，细胞膜和细胞器因此而受损。最后，细胞皱缩达到最大程度，水分不再从细胞内进入细胞外，而此时由于细胞外冰晶继续形成，细胞外溶质浓度仍然继续增加，从而在细胞膜内外侧产生一浓度梯度。当此浓度梯度达到一定程度时，细胞外液内溶质便进入细胞，从而产生对细胞的机械性作用力，导致细胞内结构相继受损[1,2]。
第二阶段：当冷冻速度极快，温度进一步降低时，可引起第二阶段的细胞损伤：细胞内冰晶形成。通常在温度降至－15℃或以下时，细胞外出现不均质性冰核，当温度降至－40℃时，细胞内便形成均质性冰晶，细胞器如线粒体和内质网因此而发生不可逆性损伤，继之损伤细胞膜，最终导致细胞死亡。有证据表明，细胞内冰晶形成是致死性的（冰晶越大，破坏越严重）。
复温过程中，可能由于下列两种机制，引起靶细胞进一步损伤：（1）细胞内小冰晶再结晶或相互融合，形成大冰晶，后者对细胞有更强的破坏作用；（2）细胞外间隙成为低渗状态，水再进入细胞内，引起细胞肿胀，导致细胞膜破坏，从而使得一些在冷冻期未损伤的细胞在复温过程中被破坏[3,4](图2.2-1)。
A 
a b c
B 
图2.2-1 冷冻对细胞的作用
A．细胞外冰晶形成:a 正常细胞；b 细胞外冰晶形成；c 细胞外呈高渗，细胞脱水；B．细胞内冰晶形成: a 正常细胞；b 细胞内冰晶形成 ；c 细胞内结冰，细胞死亡
延迟性冷损伤
此种冷损伤主要发生于为冷冻的复温期，表现为微血管衰竭、循环中止和细胞缺氧。冷冻导致血管收缩，血流减缓，冰晶形成，最终血流停止。Brown等[8]应用激光多普勒血流计，测定冷冻对实验性鼠移植性肝癌红细胞流出量（red cell flux）的影响，发现冷冻后靶组织内血流量瞬间减少，减少时间持续8小时，冷冻24小时后血流量恢复到冷冻前水平（表 2.2-1）。这种微循环的受损显然促进了冷冻对靶组织的破坏。
表2.2-1 冷冻对实验性移植性肝癌鼠模型红细胞流出量的影响
（引自Brown NJ，et al．Br J Cancer， 1993，68．11～12）
结果以红细胞流出百分率（平均值±SE）表示。A 组：移植性肝癌鼠/冷冻；B组：正常肝鼠/冷冻；C组：正常肝鼠/假冷冻；D组：移植性肝癌鼠/假冷冻。T ：靶组织中心区；C：靶组织边缘区。*??Ｐ＜0.05（Wilcoxon test），与冷冻前比较
实验性肝冷冻显示，微、小动静脉内冰晶持续形成后，微血管扩张，进而发生一系列的结构完整性破坏：血管内皮层破坏，血管壁通透性增加，出现小孔，血管内液外渗以及引起间质水肿；血小板凝集，微血栓形成，最终血流淤滞和闭塞，组织缺血缺氧，在冷冻期残存的细胞可因此而被破坏。由于微、小动脉内血流流速比静脉内快3倍，血流的热交换作用可缓冲冷冻的作用，因此，微、小静脉内这种现象最明显。在初次复温10~20分钟内，冷冻区循环障碍常可逆转，再次冷冻时则循环往往受破坏严重，难以恢复[5]。
必须指出的是，虽然微、小动静脉在复温后4小时内仍难恢复，但大的血管，尤其大的动脉一般不受破坏，即使受损，在其后24小时内一般仍能恢复[6,7]，这在临床治疗中具有实际意义，使得临近大血管的肿瘤能安全地接受冷冻治疗。这是冷冻优越于其他以高温为基础的消融治疗之处。
冷冻的延迟作用还包括免疫促进作用。肿瘤细胞反复冻融后，细胞破裂、细胞膜溶解，促使细胞内和处于遮蔽状态的抗原释放，解除肿瘤对机体的免疫抑制状态，提高抗肿瘤免疫的能力，从而启动对肿瘤细胞的免疫杀伤作用（详见“2.3 冷冻治疗与免疫”）。
易溶性冷结晶学说
对于前述冷冻损伤中溶液效应的作用，早先认为主要系由于冰晶形成后溶质浓度升高[9]；另有学者则认为，未结冰部分的容量比之溶质浓度更有损伤作用[10,11]。进一步研究发现，溶液效应涉及生理溶液中多种成分如水分、电介质（主要NaCl）、蛋白质和其他许多溶质的复杂的期相性改变（phase change behavior），其中一重要变化即易溶性结晶形成（eutectic crystallization）。
所谓易溶性结晶形成系指非冷冻成分（水和溶质）同时固体化（simultaneous solidification），即形成水合物（hydrates）（图2.2-2）[12]。当持续冷冻达到易溶性温度（eutectic temperature）即超冷状态时，易溶性结晶体即形成[13]。
应用微分扫描热量计测定磷酸盐缓冲液（PBS）在冷冻过程中期相性变化[14]。将PBS冷冻至－80?C，再复温至20?C。结果显示：冷冻开始后，冰晶首先形成，热力曲线呈现散热峰 A（exothermic peak A）（图2.2-2“A” ）；随着温度降至超冷状态，易溶性结晶形成，显示散热峰 B（图2.2-2 “B” ）；复温期，当温度升至热动力学平衡状态时，易溶性结晶溶解，显示吸热峰C（endothermic peak C）（图2.2-2 “C”）；随着温度进一步提高，冰晶也溶解，显示吸热峰D（图2.2-2“D” ）。
图 2.2-2 微分扫描热力图（5X PBS 冷冻/复温，温度梯度 5?C/min）
（引自Han B，and Bischol JC．Cryobiology， 2004，48：8～21）
2个散热峰（A 和B），A峰表示冰晶生长过程中热释放，B峰表示超冷状态下易溶性结晶形成；复温过程中出现吸热峰（C和D）。C表示热动力平衡易溶性温度下易溶性结晶开始溶解直到完全溶解，D表示冰晶溶解
应用冷显微镜也可观察到PBS在冷冻过程中的期相性变化[14]（图2.2-3）。当温度为－3.2?C时，小冰晶形成（图2.2-3 A中“I”），成为冰核；随着温度下降，冰晶不断生长，在冰晶与冰晶之间未结冰区域（图2.2-3 B中“U”），溶液浓度升高，逐步达到易溶性结晶形成浓度；当温度降至－37?C时，未结冰区域易溶性结晶形成（图2.2-3 C），并沿着未结冰区域不断扩散（图2.2-3 D）。
A B C D
图2.2-3 ???PBS 冷冻过程中冰晶与易溶性结晶形成的冷显微镜观察
（引自Han B，and Bischol JC．Cryobiology， 2004，48：8～21）
A－期相性改变温度下冰核；B－热动力学平衡易溶温度下未结冰区域冰晶；C－易溶性结晶开始形成；D－易溶性结晶形成完成。图像摄于温度：A －3.2?C,B-22.1?C,C -36.6?C,D -38.8?C。标尺50μm.I：冰，U：未结冰区域，箭头：易溶相
在细胞的立即性冷冻损伤中，易溶性结晶形成起着重要作用[14]。应用冷显微镜观察AT-1鼠前列腺肿瘤细胞PBS悬液在冷冻过程中的变化，结果显示：首先冰晶在细胞外形成，包绕细胞（图2.2-4 A和B）；细胞被截留于冰晶与冰晶之间，细胞脱水皱缩（图2.2-4C和D）；当温度进一步降低时，易溶性结晶形成，并不断扩展，直接损伤细胞（图2.2-4E和F）。
A B C
D E F
图2.2-4 AT-1 细胞悬液中易溶性结晶体形成
（引自Han B，and Bischol JC．Cryobiology， 2004，48：8～21）
A/B．细胞外冰晶（冰核）形成（箭头所指）；C/D．易溶性结晶体形成前，在冰晶与冰晶之间为未冷冻区，处于易溶结晶相；E/F．易溶性结晶体形成。
温度：A．－2.8℃；B．－5.1℃；C．－30.7℃；D．－25.6℃；E．－43.8℃；F．－37.6℃（－22.1℃）。标尺为50μm
根据以上实验，Han 和 Bischof[14] 认为易溶性结晶与冰晶在冷损伤发生中具有相似作用，但两者不是同一物，既各自独立发挥作用，又相互促进。易溶性结晶对靶细胞的作用包括细胞外与细胞内两部分。
对细胞膜的损伤
细胞外间隙冰晶形成后，细胞膜暴露于未结冰部分，周围被大的冰晶包围，但这些冰晶不一定直接损伤细胞。与相对大的冰晶不同，易溶性结晶因其十分细小，可充填于细胞外冰晶与细胞膜之间的间隙，可直接损伤细胞膜，引起细胞膜破裂，并进而导致细胞内易溶性结晶形成。
对细胞内结构的损伤
一方面，细胞外易溶性结晶可通过损伤的细胞膜进入细胞内；另一方面，细胞外间隙冰晶和易溶性结晶形成后，细胞内脱水，溶液浓度增加；随着温度进一步降低，当进入超冷易溶状态时，细胞内也形成易溶性结晶。细胞内易溶性结晶更具有损伤作用，一方面可直接引起细胞内结构（包括线粒体等细胞器）损伤（图2.2-5），同时可促进细胞内冰晶形成，加剧后者的破坏作用。
图2.2-5 冷冻时易溶性结晶形成对靶细胞的损伤作用
（引自Han B, and Bischol JC．Cryobiology， 2004，48：8～21）
当冷冻开始后，首先细胞外间隙结冰，未结冰部分的溶质浓度升高，为维持渗透压平衡，细胞内水分进入的细胞外间隙，细胞脱水。随着温度降低，细胞外溶液内形成易溶性结晶，后者直接损伤细胞膜，并可通过原先存在的膜孔隙或损伤裂口，进入细胞内间隙，导致细胞内易溶性结晶形成
易溶性结晶形成引起的冷冻损伤对冷冻治疗具有意义。实验研究显示在冷冻区加入其他溶质，例如KNO3或KCl，可使易溶性结晶形成的临界温度提高（图2.2-6），因此，如果在冷冻过程中，注射或输注其他溶液，可使在相对不太低的温度下获得较佳的冷冻效果。
图2.2-6 易溶性结晶与溶质的关系
（引自Han B，and Bischol JC．Cryobiology， 2004，48：8～21）
在不同的介质中，易溶性结晶形成的临界温度和细胞存活率有差异
细胞凋亡在冷冻损伤中作用
凋亡是细胞死亡的特殊形式。引起凋亡的信号传导途径有两种：一是由受体介导（细胞膜），另一是线粒体介导。受体介导途径主要通过关键性细胞死亡受体（如Fas/CD95×TNFR1、DR3、DR4和DR5）。受体信号启动后，caspase活化，导致细胞死亡；线粒体介导途径可被多种刺激激发；如化疗药、照射等。该途径激发后，Bcl-2家族蛋白出现变化。Bcl-2家族包括前凋亡（Bax、Bad、Bak、Bok、Bid、Bik、Bim、Bcl-Xs、Krk和Mtd）和抗凋亡（Bcl-2、Bcl-Xl、Bcl-w、Mcl-1）成员。这些成员位于线粒体膜，阻抑线粒体传导孔（mitochondrial transition pore formation）形成。在应激性刺激后，前凋亡成员从细胞质移位至线粒体膜，打开线粒体传导孔，线粒体内细胞色素C释放入细胞质内。细胞色素C再与Apaf-1 和pro-caspase-9相互作用，启动蛋白酶级联，引起细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调节中起重要作用，若Bcl-2或Bcl-X1过度表达，则会导致凋亡抑制。
在亚低温下（例如在冷冻区边缘部分），冷冻主要引起靶细胞凋亡。Hollister等[15]认为，凋亡是冷冻温度未降至足以杀灭靶细胞的情况下，导致细胞死亡的重要机制。当细胞暴露于低于－15℃的温度时,主要经历坏死而死亡，如果暴露于不低于－15℃的温度时，则主要通过淍亡而死亡。作者发现，如果加上凋亡抑制剂，即使温度降至－75℃,细胞也不会死亡。Clarke等[16]发现，前列腺癌细胞暴露于－10℃～－40℃，细胞存活率降低10%～95%，如果在冷冻前加上Caspase-1抑制剂（抑制凋亡），则可引起细胞存活率明显提高（以在－15℃～－20℃下保护作用最明显），总保护率为15%～20%。应用Western blot 分析凋亡蛋白caspase-9，发现冷冻复温后此种蛋白立即增加，9小时达高峰，增加1.4倍，复温后18小时回复对照水平。复温初始9小时内caspase-9水平升高，随之pro-caspase-9水平减低，表明caspase-9被激活，提示在冷冻引起的细胞死亡中线粒体相关性凋亡系统被激活。应用荧光基质（fluorogenic substrate）技术分析caspsae-3 蛋白酶活性，显示在复温后酶活性迅速降低，3小时上升，6小时达峰值（达非冷冻对照组的3.4倍），并维持高水平达24小时。这些资料均说明冷冻引起的细胞死亡中凋亡起重要作用。
亚低温下靶细胞凋亡, 对于提高冷冻区域周边部冷冻效果具有意义。但这可能仅是理论上的，无实际价值，因为该部位冷冻引起的细胞凋亡，若不能保证靶细胞全部死亡，则这些细胞可成为疾病复发根源。但有研究表明，如冷冻前、中、后加上化疗,可使在亚低温下冷冻引起的靶细胞死亡增加，这对临床上应用综合治疗（冷冻+化疗）具有指导意义。
结语
冷冻疗法对靶组织的破坏作用有立即性和延迟性，前者包括细胞外冰晶形成、细胞内冰晶形成和细胞内外易溶性结晶体形成，后者包括微血管衰竭和免疫促进作用。在亚低温下（例如冷冻区边缘部分），冷冻主要通过凋亡引起靶细胞死亡。
