- 冷冻治疗与化学治疗（化疗）具有协同作用。临床观察显示在冷冻的同时局部或区域应用化疗药物，可使一些进展型或复发性肿瘤得以缓解甚至消除
- 冷冻可增加瘤细胞对化学药物的通透性。冷冻有效区域及邻近的低温区域抗癌药浓度高于未冷冻的周围区域，肿瘤破坏也比一般的单用化疗后多。肿瘤冷冻后摄取化疗药增加的原因尚不明，可能与肿瘤内血管容量及血管壁通透性增加有关
- 化疗药能提高冷冻杀伤靶细胞的效果。在亚冷冻条件下，给予低剂量化疗药，可增加冷冻引致的靶细胞破坏，这对于强化冷冻区周边病灶的消融具有意义
- 化疗药在分子水平增强冷冻的效果。冷冻与化疗药分别激活抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax。冷冻温度未降至足以杀灭靶细胞情况下，凋亡是导致细胞死亡的重要机制。当细胞暴露于高于-15℃环境时，主要通过凋亡而死亡；如暴露于低于-15℃,则主要经历坏死而死亡。化疗药引起Bax表达增加，从而促进冷冻引起的细胞凋亡
- 抗癌药给予时间应与冷冻后血管的改变相一致，最适时间是血管扩张及血管通透性达最大程度时,一般在冷冻后1小时；由于冷冻后血管容量突然显著减少，因此局部给予长效油剂抗癌药（主要注入肿瘤周边部分）更有效
- There is a synergistic effect in combining cryosurgery with an anticancer drug. Clinical observation showed the inhibition or eradication of advanced or recurrent carcinoma with a combination of cryosurgery and regional or local administration (intraarterial continuous infusion or local injection) of anticancer drugs.
- Cryosurgery enables the anticancer drugs to be trapped in the tumor or periphery of the tumor. It is suggested that the tumor vessels dilate and increase in permeability sharply and quickly after cryosurgery, hence the anticancer drug would be concentrated in the tumor.
- Chemotherapy can increase the efficacy of cryosurgery. With cryochemotherapy certain anticancer drugs accumulate in a high concentration at the periphery of the tumor, thus multiplying the tumor-destrestrying effects of cryosurgery.
- Sub-freezing temperatures, then sequentially applied with low dose chemotherapy, may provide improved cancer cell death in the freeze zone eriphery. Since the mechanism of action of most common chemotherapeutic agents is to initiate apoptosis in cancer cells, the observation that sub-freezing exposures yields a similar effect provides a possible route toward molecular based procedural optimization to improve therapeutic outcomes.
- Molecular analysis indicated that freezing and chemotherapy differentially activated apoptotic cascades through modulating opposing members of the Bcl-2 protein family. Freezing results in a time-dependent increase of the antiapoptotic Bcl-2 protein, while chemotherapy results in an increase of the pro-apoptotic Bax protein. The increase in Bax was also apparent following the combination of 5-FU/freezing, while Bcl-2 levels were maintained at or below control levels. This led to a shift in the Bcl-2 to Bax ratio to a pro-death tendency. The combination of cisplatin/freezing resulted in a 4- fold increase in the ratio of Bax to Bcl-2 when compared to controls, which represented a 2-fold increase over the 5-FU/ freezing-combination model. This increase may contribute to the continued reduction in cell number observed during the recovery period. The data suggest that both Bcl-2 and Bax may, not only, play an important role in the efficacy of the cryo/chemo combination, but also the balance between the two may determine the role and extent of system destruction.
- Clinically, the methodology of cryochemotherapy needs attention. For example, anticancer drugs should be administered while the vascular permeability is highest, one hour after cryosurgery, but vascular volume decreases abruptly and markedly after cryosurgery. In this respect, locally long-lived oil-based anticancer agents are of preference for use in conjunction with cryosurgery.
冷冻治疗与化学治疗（化疗）联合应用治疗肿瘤，其含义相当于手术联合化疗。冷冻与化疗本身可能有相互促进作用。
类似于手术与化疗的作用
手术与化疗的关系已明确，术前（新辅助化疗）和术后（辅助）化疗可提高手术效果，减少术后复发与转移[1]。冷冻的目的是消融肿瘤组织，其意义相当于手术切除。因此,化疗也可在冷冻前、后应用。
冷冻后化疗
冷冻为局部治疗，对一些比较局限的、播散趋向很小的肿瘤可治愈，但一般不能预防远处转移；而化疗属于全身性治疗，可肃清体内残存癌细胞或微小转移灶，预防复发或转移，并使得易于播散的肿瘤有相当一部分可治愈。例如局限性乳腺癌冷冻治疗后，虽可消除原发灶，但全身血液内仍可有癌细胞，需要化疗予以肃清；肝细胞癌经冷冻治疗后，肝动脉化疗栓塞（TACE）可显著降低复发率。
冷冻前化疗
相当于手术前新辅助化疗，目的在于缩小肿瘤，以利冷冻的进行。大肝癌冷冻治疗前作肝动脉化学栓塞即具有此作用。
姑息性治疗
进展型肿瘤（包括肿瘤体积较大，或多发性，或已有转移），冷冻可消除主要肿瘤或大部分肿瘤，减少瘤负荷，便于化疗发挥作用，以达到改善症状，延长存活期的目的。
临床观察
Benson[2,3]报道，冷冻联合区域性动脉内持续灌注化疗48小时，对头颈部鳞状细胞癌产生明显疗效。Ikekawa[4]列举两例复发性舌癌，经过冷冻加上局部灌注油型bleomycin治疗后，取得良好效果。
例1 男性，46岁，复发性舌癌（左侧）。肿瘤内注射bleomycin油剂30mg,随后立即冷冻治疗。结果显示肿瘤完全被消融，留下组织缺损，但无舌功能障碍。患者生存14年以上（图2.4-1）。
A B
图 2.4-1 左侧复发性舌癌冷化学治疗前后外观
（引自Ikekawa S．in： Korpan NN． Ed． Basics of Cryosurgery.WeinNewYork:Springer-Verlag.2001:25-30）
A.冷冻前表现；B.冷化学治疗后10年舌外观，见组织缺损和疤痕，但无复发。
例2? 女性，85岁，复发性舌癌。肿瘤侵犯下颌骨。肿瘤内及其附近注射bleomycin油剂30mg，随后冷冻。肿瘤获得完全清除（图2.4-2）
A B
图 2.4-2? 复发性舌癌冷化学治疗前后外观
（引自Ikekawa S．in：Korpan NN．Ed．Basics of Cryosurgery.WeinNewYork：Springer-Verlag，2001：25-30）
A．冷冻前舌癌，已侵犯下颌骨；B．冷化学治疗后6个月，舌功能保留，未查到癌细胞
笔者所在广州复大肿瘤医院曾治疗一例，胃癌肝转移、腹腔转移患者，经冷冻加小剂量5-FU治疗后，症状明显改善，列举如下：
例3 女性，38岁。发现眼黄，上腹胀痛半个月，入院检查发现进展期胃癌（Borrmann III型），伴肝内广泛转移。腹腔内大量血性脱水，首次抽吸2000ml后腹腔内仍残存甚多。血丙氨酸转氨酶(ALT) 260u，门冬氨酸转氨酶(AST) 280u，γ-谷氨醯转肽酶(γGT) 569u，碱性磷酸酶260u，总胆红素216μmol/L。 CT 显示肝内大小不等转移瘤，难以计数。对肝内较大转移瘤作经皮冷冻治疗，共冷冻12个病灶，同时腹腔动脉置管灌注5-FU，每天250mg。10天后黄疸、腹水明显减少最后消失，酶指标下降；1个月后复查CT，显示肝内癌块大部分消失，PET-CT显示肿瘤代谢活性呈低水平（图2.4-3）
A B C
图 2.4-3? 胃癌肝转移接受冷冻和5-FU治疗前后的CT与PET-CT表现
A.治疗前CT显示肝内布满转移瘤；B.冷冻加化学治疗1个月后CT，肝内病灶明显减少；C.PEI-CT 显示肝内肿瘤代谢活性呈低活性
上述是从临床观察角度来考虑冷冻与化疗的联合应用。至于冷冻与化疗两者本身相互之间有无作用，目前尚研究不多，现有的资料提示：（1）冷冻可促进化疗药对癌细胞的作用；（2）化疗药可增强冷损伤作用。
实验研究
??? 冷冻对化疗药的作用
Mir[5]发现冷冻可增加黑色素瘤细胞对化学药物的通透性。争光霉素在正常情况下不能进入细胞内，而冷冻后此药能进入，因此作者推荐其作为黑色素瘤的主要化疗药物。
Homasson 等[6]对12例进展期、不适合手术切除的支气管癌患者作了前瞻性研究。给患者静脉注射15 mg 57CO标记的争光霉素，然后置于伽玛照相机下，以记录57Co争光霉素从血中消失的时间活性曲线。上述实验分别在冷冻治疗前与治疗后各作一次。药物动力学参数显示，冷冻治疗后争光霉素血浆清除率加速，肿瘤对争光霉素的摄取率在冷冻治疗后较治疗前增加30%；冷冻区和邻近的低温区抗癌药浓度高于未冷冻的周围区，肿瘤坏死也比一般的单纯化疗后为多。作者推测冷冻破坏了肿瘤血管，血浆内化疗药在首过肿瘤时即被瘤组织摄取。
Ikekawa[4]作鼠实验研究也证明肿瘤冷冻后摄取抗癌药增加。给鼠背部皮下接种黑色素瘤细胞5×105/鼠，以制作实验性肿瘤，然后将鼠分为两组，一组为冷冻组，10天后应用接触法对肿瘤进行冷冻。冷冻前1小时和冷冻后5分钟、1小时和3小时腹腔内注入peplomycin 10mg/kg；另一组为对照组，仅注射peplomycin，不予冷冻。给药后1、2、4和8小时，分批将鼠处死，采集标本检测药物浓度。结果显示，所有鼠的血、肝、肾内药物浓度均迅速降低，冷冻组和对照组之间无差异（图2.4-4），但肿瘤内药物浓度在冷冻组明显高于未作冷冻的对照组（图2.4-5）。
图2.4-4 冷冻后血液和器官内peplomycin浓度
(引自Ikekawa S． in： Korpan NN．Ed．Basics of Cryosurgery．WeinNewYork：pringer-Verlag．2001：25～30)
图2.4-5 冷冻后肿瘤内peplomycin浓度
(引自Ikekawa S．in： Korpan NN． Ed． Basics of Cryosurgery．WeinNewYork：Springer-Verlag．2001：25～30)
- 冷冻加peplomycin注射
- 仅peplomycin
肿瘤冷冻后摄取peplomycin增加的原因尚不明，可能与肿瘤内血管容量与血管壁通透性增加有关。有研究发现肿瘤冷冻后30分钟血管容量增加7倍，1小时后回复对照水平；相应地，血管壁通透性增加8倍。但肿瘤冷冻后对化疗药的摄取可能也与药物本身特性有关，因应用adrimycin代替peplomycin作同样实验，未显示肿瘤对该药的优势摄取。
化疗药对冷冻的作用
实验研究证明，化疗药能提高冷冻杀伤靶细胞的效果，这一作用是通过促进细胞凋亡而实现的。
Baust 等[7]观察了3种瘤细胞（前列腺癌细胞系PC-3 、结直肠癌细胞Caco-2 和HT-29）对冷冻或冷冻-化疗药的耐受性。将培养的瘤细胞暴露于-10℃、-15℃ 和-20℃，或暴露-15℃ / 化疗药，或单纯暴露于化疗药20 分钟，然后在室温中复温25分钟，再移至37℃培养基中，测定存活率。 结果：
（1）冷冻至-10℃，三种细胞均死亡很少，复温后迅速恢复至对照水平；冷冻至-15℃，PC-3 和HT-29存活率分别减少25%和45%，但复温后第7天，这两种细胞均复活，几乎达到冷冻前对照水平；冷冻至-20℃，也出现类似结果。Caco-2 对冷冻很敏感，复温后第1天仅不足20%的细胞存活，冷冻至-15℃的细胞随着复温时间延长有一部分复活，而冷冻至-20℃的细胞复活甚少。（图 2.4-6 ）。
图2.4-6? PC-3 、Caco-2 和HT-29冷冻复温后不同时间的存活率
（引自Baust JG， et al．Cryobiology 2004；48：190～204）
细胞存活由calcein-AM测定（根据calcein 荧光滞留，反映膜完整性）。存活率以占37℃下非冷冻对照细胞数的%表示
（2）将上述细胞暴露于冷冻加化疗药时，则引起80% 以上细胞失去存活能力，而且复温后至8～14天仍无复活。将瘤细胞单纯暴露于化疗药，无论是顺鉑抑或5-FU，细胞存活率无明显减少，叶酸无论是单独抑或与冷冻联合作用，均对细胞存活率无明显影响（图2.4-7，图2.4-8）。
图2.4-7? PC-3暴露于冷冻（-15℃）、 冷冻－5-FU / 顺铂（cis）/ 叶酸（FA）后存活率(复温后15天测定)
（引自Baust JG，et al．Cryobiology， 2004，48：190～204）
图2.4-8? Caco-2 和 HT-29暴露于冷冻（-15℃）和冷冻/顺铂（cis）后存活率（复温后8天测定）
（引自Baust JG，et al．Cryobiology ,2004,48：190～204）
结论：在亚冷冻条件下，给予低剂量化疗药，可增加冷冻所致的靶细胞破坏。这对于强化冷冻区周边病灶的消融有指导意义。
Clarke等[8]研究了冷冻-化疗药联合应用提高冷冻效果的分子机制。试验对象为培养的前列腺癌细胞系（PC-3）。结果：
(1)先给靶细胞施加化疗药再予冷冻（－15℃），发现对细胞的破坏作用强于单独应用冷冻时（图2.4-9 ）。单独暴露于冷冻或一种化疗药，虽然初期部分细胞失去生存能力，但稍后又会复活。如果将细胞先暴露于5种化疗药中一种，再予以冷冻，则细胞存活能力明显降低。暴露于5-FU-冷冻的细胞在2天后仅24％～28％存活，暴露于其他化疗药和冷冻的细胞失活的更多，14天后存活细胞减至7％～9％。
图2.4-9? PC-3细胞存活率（彩图参见p???? ）
(引自Clarke DM，et al． Cryobiology， 2004，49：45～61)
单独暴露于冷冻（-15℃）或同时暴露于冷冻/化疗药5-FU（190μM）、taxotere(tex)(10μM)、etoposide(etop)(50μM)、顺铂(cis) (25μM)或叶酸(FA)（50μM）后细胞存活率（±SEM）有显著差异
(2)冷冻引起抗凋亡Bcl-2蛋白时间依赖性增加。应用Western blot 技术分析两种基因蛋白（Bcl-2蛋白和Bax蛋白），发现暴露于冷冻的细胞Bcl-2蛋白水平在复温后12小时开始上升，至24小时达峰值；Bax蛋白在复温后初期增加，然后持续处于低水平（图2.4-10 A 和D）。Bcl-2／Bax比率在冷冻初期稍高于对照组，然后降低，再后又上升，复温后18小时高达对照组3倍，24小时达3.5倍，48小时回降至对照水平（图2.4-11）。
图2.4-10 前列腺癌细胞PC-3 的Bcl-2和Bax蛋白水平
(引自Clarke DM，et al． Cryobiology 2004；49：45～61)
分别暴露于－15℃（A）、5-FU（B）或冷冻（－15℃）+5-FU后Bcl-2蛋白与Bax蛋白水平；Bcl-2、Bax和lubulin应用膜电泳法分离，蛋白水平按Western blot 分析法定量（D）
图2.4-11 前列腺癌细胞PC-3的Bcl-2/Bax比率改变
(引自Clarke DM，et al． Cryobiology 2004；49：45～61)
分别暴露于冷冻（-15℃）和/或5-FU后，Bcl-2/Bax比率显示：冷冻引起比率向细胞活存信号移动，而冷冻加化疗药引起比率向死亡信号移动
（3）化疗药引起前凋亡Bax蛋白增加：靶细胞暴露于5-FU后，初期Bcl-2水平稍高于Bax，但12小时后，Bax水平明显增加，Bcl-2水平则降低。在除去药物后２４小时，Bax水平高于对照组2倍（图2.4-10 B 和D）。
（4）靶细胞先暴露于化疗药5-FU再冷冻后，Bax增加，在初18～24小时内维持于高水平，48小时后降低；而Bcl-2水平初期增加，6小时后明显降低，48小时后回复至对照水平（图2.4-10 C 和D）。Bcl-2／Bax比率维持低于对照组的水平。
（5）靶细胞暴露于顺鉑／冷冻后，Bax蛋白水平显示类似增加，且较暴露于5-FU／冷冻后增加更明显。在复温后第１天即达峰值，为对照组3.5倍，此后１周内维持高水平（图2.4-12）。Bcl-2水平一直处于与对照组相似水平。相应地，Bcl-2／Bax比率维持低水平，并较暴露于5-FU／冷冻后低（图2.4-13）。
图2.4-12? 前列腺癌细胞（PC-3）的Bcl-2与Bax的改变
(引自Clarke DM，et al．Cryobiology 2004；49：45～61)
分别暴露于冷冻/5-FU（A）和冷冻/顺铂（cis）（B）。冷冻/顺铂（cis）处理后Bax蛋白升高大于冷冻/5-FU处理后（C）
图2.4-13? 靶细胞暴露于顺鉑／冷冻后Bcl-2／Bax比率
(引自Clarke DM， et al．Cryobiology， 2004，49：45～61)
Bcl-2／Bax比率维持低水平，低于暴露于5-FU／冷冻后
（6）凋亡抑制剂不会减少靶细胞因化疗药/冷冻引致的死亡。将caspase抑制剂加入培养系统中，测定靶细胞在暴露于化疗药/冷冻后的存活率，发现此种抑制剂仅对7%～9%细胞提供保护，即不会明显影响化疗药/冷冻对靶细胞的损坏作用。
（7）靶细胞暴露于化疗药/冷冻后坏死性死亡增加。应用calcein-AM与propidium iodide（PI）荧光染色，分别检测存活的与坏死的靶细胞。结果显示，冷冻后calcein阳性细胞迅速减少，PI阳性细胞迅速增加；暴露于化疗药／冷冻后此种改变更加明显（图2.4-14）。
图2.4-14前列腺癌细胞（PC-3）的染色荧光显微镜观察
(引自Clarke DM，et al． Cryobiology， 2004，49：45～61)
分别暴露于5-FU(48小时)、冷冻（-15℃）及5-FU加冷冻后，细胞calcein-AM与propidium iodide（PI）染色：PI阳性（红色）示坏死细胞，calcein阳性（绿色）示存活细胞
结论：抗癌化疗药能在分子水平增强冷冻的效果。冷冻与化疗药分别激活抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax。冷冻温度未降至足以杀灭靶细胞情况下，调亡是导致细胞死亡的重要机制。当细胞暴露于高于-15℃环境时，主要通过凋亡而死亡；如暴露于低于-15℃,则主要经历坏死而死亡。化疗药引起Bax表达增加，从而促进冷冻引起的细胞凋亡。
Le Pivert 等[9]观察了冷冻联合5-FU微囊对移植前列腺癌模型生长的影响。给裸鼠皮下植入人前列腺癌细胞，制造异种移植性肿瘤。实验模拟人前列腺癌姑息性冷冻方法，对大部分病灶给予冷冻，留下一部分病灶给予冷冻或/和局部注射5-FU微囊。应用超声和生物发光指数（BLI）测定肿瘤细胞存活情况。结果显示：（1）实验后第4天，对照组BLI肿瘤细胞数高于注射5-FU组的5.6倍，第7天仍高于2.7倍；（2）部分冷冻的肿瘤平均BLI 在第3天低于未冷冻肿瘤20倍，第7天低46％；（3）联合冷冻和5-FU引起肿瘤生长明显抑制。未处理肿瘤的存活细胞BLI在第3天是处理肿瘤的34倍，第7天增至350倍。上述资料说明，冷冻加上局部注射化疗药物对肿瘤能产生协同性抑制作用。
讨论
在冷冻治疗中联合应用化疗，是肿瘤综合治疗的重要策略。在此，应考虑以下问题：（1）冷冻后局部微循环：冷冻后，冷冻区微循环遭受破坏。复温后立即见到血管收缩，随之扩张、充血和血流郁滞，最后发生血栓形成和血流完全中断，导致组织坏死。Zacarian等[10]发现复温期注入血管的Evans易泄漏入组织内。因此，如注射化疗药也会较多地进入瘤组织内；（2）正常组织与肿瘤组织的血管对冷冻的反应性不同，肿瘤血管在冷冻后往往迅速且显著扩张，通透性增加，因此抗癌药可聚集到肿瘤内；（3）抗癌药给予时间：应与冷冻后血管的改变相一致，最适时间是血管扩张及血管通透性增加达最大程度时。一般在冷冻后1小时给予抗癌药最合适；（4）选择合适抗癌药：已知5-FU、DTIC 和peplomycin 能被肿瘤所摄取[11,12]，而阿霉素则否；（5）给药方式：选择性或超选择性动脉灌注可增加局部抗癌药浓度。有学者报告某些血管活性药物如血管加圧素（angiotensin） II 能选择性增加肿瘤血流[13]。由于冷冻后血管容量突然显著减少，因此局部给予长效油剂抗癌药可能更有效；（6）Fujimura [14]在动物实验发现，冷冻后3～24 小时内给予5-FU，药物主要聚集于肿瘤边缘区而非中心区。因此如局部给药，主要应注入肿瘤周边部分，从而弥补冷冻区周边部消融可能不彻底的缺陷。
结语
冷冻与化疗具有相互促进作用。临床观察发现，化疗与冷冻联合可提高疗效；实验研究显示冷冻能促进化疗药进入瘤细胞，化疗药也能强化冷冻的效果。如能掌握合适给药时间、选择合适药物，采用适当给药方式，有可能产生协同作用。
