肿瘤逃避免疫应答

　　多数情况下，机体免疫系统对肿瘤的发展影响甚微，这是由于肿瘤具有多种逃避免疫应答的机制：（1）瘤细胞表面肿瘤相关抗原被隐隐匿或表达不足；（2）由于激素因素或无效性抗癌应答，瘤细胞表面抗原-抗体复合物脱落或内化；（3）组织相容复合物（MHC）抗原丢失，导致无法递呈肿瘤抗原肽。约有50%以上的肿瘤可以丢失一个或几个MHCI类等位基因，有时则丢失所有MHCI类抗原。（4）免疫抑制因子（如前列腺素-E2,PGE2）、细胞因子（白介素-10，IL-10）和转化因子B(TGF-B)分泌不足，T细胞活性和 CTL溶细胞活性下调；（5）瘤细胞缺乏淋巴细胞粘附所需的分子，如LFA-1、LFA-3和ICAM-1，或者表达有抗粘附作用的分子[2]。
　　虽然上述机制造成了肿瘤逃避免疫应答，但目前认为，更重要的是机体抗原递呈作用的不足，以致即使产生效应细胞，也很难识别和杀死肿瘤细胞[1,2]。

抗原递呈和树突状细胞

　　抗原递呈在启动和维持对一种抗原的适当免疫应答中起关键性作用。不同类型的抗原递呈细胞在不同情况下发挥作用。在淋巴器官内，主要的抗原递呈细胞有三种：树突状细胞（Dendrific cells,DC）、巨噬细胞和B细胞，其中以DC最主要。
　　DC主要来源于骨髓，存在于皮肤、淋巴结、脾脏、大部分黏膜上皮内或上皮下，以及胸腺内。有三种DC：（1）并指DC（IDC），存在于上皮中，以郎格汉斯细胞形成存在，含有特征性Birbeck颗粒，作为未成熟的“隐匿性细胞”（veiled cell），经淋巴管迁入引流淋巴结的副皮质区（T细胞区），与T细胞相互作用，成为成熟DC；（2）滤泡DC（FDC）：存在于淋巴结、脾脏和黏膜相关淋巴组织（MALT）B细胞区的一级和二级滤泡中，可递呈抗原给B细胞。FDC为非迁移细胞群，通过细胞桥粒建立细胞间牢固联系，而形成稳定网络。FDC缺乏MHCII类分子，通过补体受体，（CD21或CD35）结合抗原；（3）生发中心DC（GCDC）：存在于B细胞区二级滤泡生发中心，是一群迁移细胞，到达生发中心后与T细胞相互作用；（4）胸腺IDC：存在于胸腺髓质，在T细胞发育和成熟中起主要作用。在肿瘤免疫中起作用的DC主要是IDC。

    未成熟DC能有效地捕捉抗原，这一过程系通过以下机制完成：（1）摄取；（2）巨胞饮（macropinocytosis）；（3）吸附和（4）受体（甘露糖受体、C型凝集素受体、FC受体）介导的细胞内饮作用（endocytosis）。由于这些机制，DC可在抗原浓度甚低的条件下捕捉抗原。

　　可溶性或特殊性抗原在DC细胞内被加工，在细胞内吞噬性溶酶体内蛋白水解酶作用下，降解成抗原肽，后者与MHC　II类分子相结合，进而提呈给T细胞[3]。但DC也能将吞饮的凋亡小体、细菌或可溶性抗原，通过MHC　I类途径，与MHC　I类分子结合，交义提呈（cross-present）给CD8＋T细胞。这一途径称为内途径。有认为交义提呈取决于吞饮的物质类型，仅仅凋亡细胞能进入内途径，而坏死细胞则否。

　　DC一旦成熟，便失去捕捉抗原的能力，但具有下列作用[4,5]：（1）通过上调I和II类分子、共刺激分子（CD80，CD86）而显著增强T细胞刺激活性。此时，MHC-肽复合体在细胞表面的转换率降低，并稳定存在持续若干天；（2）上调一系列细胞因子生成，如IL-12，IL-15，这些因子可上调T细胞的致敏/激活或直接增强CD4＋T辅助细胞（Th）的应答；（3）DC还能拮抗肿瘤细胞对T细胞的溶解作用，从而延长肿瘤内T细胞寿命。这对疫苗治疗的设计甚为重要[6]；（4）活化的T细胞除了表达分子如CD40配体外，还释放诸如γ-干扰素和粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子（GM-CSF）等细胞因子，反过来促进DC的抗原递呈作用。
DC细胞的体外分离

有以下几种分离DC的方法：

1．密度纯化法（density-based purification）：从血中直接分离DC前体细胞，然后在体外培养使其变成成熟DC。但由于循环中DC前体尚不到外周血单个核细胞的1%，因此即使采用白细胞分离仪也很难得到足够数量的DC。为了有效地从血中直接分离出DC，有人主张先用C-fms样酪氨酸配体3（Fit3 ligand）处理，扩充循环DC，此法可使DC量增加10－15倍[7]。

2．从血中分离DC14＋单个核细胞或CD34＋前体细胞：CD14＋单个核细胞与IL-4、GM-CSF一起培养后，分化为DC。有人主张在培养中加上其他细胞因子，如SCF、Flt3配件和/或α肿瘤坏死因子（TNF-α），可提高分离效果。有认为从CD34＋前体分离的DC比之从单个核细胞分离的DC更能有效地激活T细胞，但未得到证实。目前，认为两种来源的DC在肿瘤免疫治疗中具有同样作用[8]。

3．使用钙离子筛（calcium ionophore,CI）: 本法简便，可迅速将CD34＋前体细胞、CD14＋单个核细胞或CML前体细胞与成熟DC分开,是分离成熟DC的有效方法。用这种方法分离的DC刺激T细胞的能力与用CD40L培育的DC完全相同[9]。

    从癌肿病人分离的DC，在体外其类型和功能活性与从健康人分离的DC无差异。但有人发现从乳腺癌病人分离的DC递呈抗原给T细胞的能力较弱[10]。

　　冷冻和融化对非成熟和成熟DC的功能均无影响，因此可以一次制备大量DC留作多个疗程使用。

DC成熟

　　非成熟DC在体外由IL-4和GM-CSF诱导产生，表达CD40、CD54、CD58、CD80、CD83、CD86，低水平表达细胞因子受体CCRT，但细胞因子受体CCR1，CCR5和CCR6则呈高密度表达[11]。前己述及，未成熟DC主要功能为捕捉抗原，有效地吞噬特殊抗原、细菌以及活的、凋亡的或坏死的细胞，可溶性抗原则通过巨胞饮或受体介导性细胞内噬作用而被摄取。

　　表型成熟性DC表达“纯”（hallmark）成熟标志CD83和P55，高水平表达共刺激分子CD80、CD86和MHC　II类分子CD40、CD54、CD58和CCR7，细胞因子受体CCR1、CCR5和CCR6则表达下调。成熟DC捕捉抗原能力差，而刺激或/和激活T细胞能力则较非成熟DC强。在体外，DC成熟可由单个核细胞条件培养基、CD40交链、病原体、肽多糖（LPS）、DNA、热休克蛋白和细胞因子等诱发。有认为摄取凋亡小体或坏死细胞或坏死细胞上清液也能促发DC成熟[12-15]。

　　非成熟DC如果没有细胞因子刺激，便逆转为单个核细胞，而成熟DC则不同，其表型相当稳定。
目前，未成熟DC和成熟DC均被用业作为疫苗，如果选用抗原负荷非成熟细胞，使之变为成熟细胞，则在临床应用上更为理想。

抗原引入DC的策略

　　将抗原引入DC的方法有多种，使用的抗原有些是己知的，有些则是未知的。

1．急、慢性粒细胞白血病时，使用的DC系来自于恶性细胞。由于病变发生于DC前体，因此无论在体外抑或体内生成的DC，均能递呈肿瘤细胞抗原。从慢性粒细胞白血病（CML）患者分离的来自单个核细胞的DC带有特征性bcr-abl抗原，诱导CML特异性CTL。这些来自病理性前体的DC的功能和表型与来自健康人的DC相似[16]。

2．将合成肽作为抗原引入DC。本法优点是抗原是预先设计的，不会引起自身免疫和交义反应，在体内、外易于调整。肽直接与特异性MHC分子结合，无需加工。合成肽冲击的成熟DC刺激T细胞的能力，超过未成熟DC[17]。
本法的缺点是仅限于具有已知抗原的肿瘤，如黑素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤，另一缺点是激发的T细胞仅对一种抗原呈现应答，因此有助于肿瘤逃避免疫反应[18]。

3． 肿瘤完整抗原引入DC。这些完正抗原包括肿瘤裂介物或酸抽提性肽混合物。应用此法可获得肽特异性或肿瘤特异性CTL[19]。有人发现应用冻-融细胞裂解物冲击的DC，不仅能有效刺激CD4＋T细胞，而且能刺激CD8＋T细胞[20,21]。

4． 用凋亡肿瘤细胞作为抗原来源。未成熟DC能有效摄取凋亡细胞。业己证明，凋亡细胞可交义递呈于MHC　I类分子上。摄取凋亡细胞的DC激发T细胞的能力，高于用放射线照射的肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物轰击的DC[22]。

5． 用坏死肿瘤细胞作为抗原。有人发现DC摄取坏死细胞后其有刺激或激活静态T细胞的能力，强于凋亡细胞冲击的DC，但未得到其他学者证实。有认为坏死细胞可为DC内化凋亡细胞提供一信号，没有这种信号，凋亡细胞负荷的DC便不能刺激T细胞，相反，使T细胞耐受状态[23]。

6． 将完整肿瘤细胞，经电融合或聚乙二醇处理后，与DC相融合，形成DC-肿瘤杂交体。融合率可达20%。与肿瘤融合的DC肿瘤杂交体，保持未融合时的表型和细胞因子表达。目前临床前或临床试验中使用的DC疫苗多半采用此法。本法的缺点是不仅肿瘤抗原，而且正常组织抗原也会被DC递呈，以致可诱发自身免疫[24]。

7． 最适宜的方法是采用载体，将己知或未知的抗原基因转染DC。有非病毒性载体，如阳离子脂质，质粒包裹的金粒，和病毒性载体，如逆转录病毒和腺病毒。前者转染效果不稳定，转染率5%－95%，后者则转染率高，且稳定，能转染未成熟DC，不会影响DC进一步成熟的能力，也不会改变DC的形态学表型或功能特性[25,26]。

8． 有人应用从肿瘤提取出的mRNA冲击DC。此种RNA被DC摄取和翻译，表达的蛋白质作为免疫性抗原可提呈于细胞表面。动物和人体实验表明这种方法冲击的DC激发抗原特异性反应的能力与肽冲击的DC相似。由于可用病理切片扩增获得mRMA，因此在理论上本法具有很大的应用前景[28]。

9．为了进一步提高DC的刺激能力，常将能拷贝刺激性细胞因子或共刺激因子的基因转染DC[29]。某些细胞因子，既能激活T细胞或直接促进T细胞进入Th1应答，也能转染入DC。己知IL-12、?-干扰素（IFN-?、IL-7、GM-CSF或lymphotactin基因转染后，DC在体内、外激活或刺激T细胞的能力显著增强。

10.延长DC寿命对保证其免疫提呈和促进功能，具有很大重要性[30]，在肿瘤微环境中，DC采用凋亡形式死亡，这一过程可能与bc1-2家族缺陷有关，应用CD40L、IL-15处理，能上调bc1-2，阻止肿瘤引起的DC凋亡。将bc1-2基因引入DC，也有类似保护作用。此外，即使DC不死亡，肿瘤释放的因子如血管内皮生长因子（VEGF）、IL-6或IL-10也能抑制DC分化和成熟，从而降低DC的免疫刺激能力。CD40L或TNG-?能逆转IL-10的此种对DC的抑制作用[31]。
　

继……