[作用与用途]

    用于肺癌、肺癌脑转移及消化道肿瘤，特别是对肺癌脑转移有较好疗效，对维持人体正常代谢功能的骨髓亦有保护作用，能升高白细胞(如白细胞300/nm以下者仍可使用本品)。
    大剂量给药未尖肝、肾功能、血象及其它实质性器官的明显变化,配合化疗、放疗可减轻以上两种疗法的毒副作用。

    [用法与用量]

    注射液：一次10-30ml，一日一次，加生理盐水250-500ml稀释后静脉滴注，稀释后立即使用。

    口服液：一日2-3 次，每次20ml，每一疗程为一个月，两疗程间不必停药，可连续服用。

    [规格]

    鸦胆子油乳注射液 10ml×10支/盒

    鸦胆子油乳对耐药胃癌细胞的生长抑制和对拓扑异构酶的影响

蒙凌华 俞丽芬* 吴云林* 陈陵际 丁 健
中科院上海药物研究所 （上海 200031）
*上海第二医科大学附属瑞金医院 （上海 200031）

摘要：

    鸦胆子油乳是一种在临床上广泛应用的抗癌剂，其主要成分为不饱和脂肪酸，与肿瘤细胞有特异性的亲和力。对MKN－28人高分化性胃腺癌耐VCR细胞株,MKN－45人低分化性胃腺癌耐VCR细胞株,SGC7901人中分化性胃腺癌耐VCR细胞株的细胞毒作用表明鸦胆子油乳对耐药细胞株具有较强的抑制作用；并可明显增强其他化疗药物对耐药细胞的生长抑制，1/4000的鸦胆子油乳可使1000mg/ml VCR对N28/VCR细胞毒作用敏感性提高206.32%.鸦胆子油乳能抑制TOPOII介导的kDNA去连环作用，完全抑制酶活力的浓度为1：40，对TOPOI介导的pBR322解旋和直接对DNA没有影响，提示TOPOII可能为鸦胆子油乳细胞内作用靶点之一,也有可能是其逆转耐药细胞株的机制之一。

关键词：鸦胆子油乳 多药耐药 DNA拓扑异构酶
　　
    鸦胆子油乳是以鸦胆子石油醚提取物为原料, 以精制大豆磷脂为乳化剂制成的水包油型乳剂。实验研究表明，鸦胆子油乳能抑制体外肿瘤细胞的增殖生长，并能明显延长肝癌腹水型荷瘤鼠的生命，另外对艾氏腹水癌、S37肉瘤、S180肉瘤、U14小鼠子宫颈癌等均具有明显的抑制其生长的作用1。目前,鸦胆子油乳在临床上主要应用于肺癌、肺癌脑转移和消化道恶性肿瘤的治疗。鸦胆子油乳的主要成分为不饱和脂肪酸，与细胞膜有特异性亲和力2。研究证实,细胞膜在细胞毒作用以及肿瘤细胞耐药性的产生中扮演了重要角色3。因此,鸦胆子油乳能否逆转肿瘤细胞的耐药性引起了我们浓厚的兴趣。此外，以往的研究表明,鸦胆子油乳能抑制DNA的生物合成，而DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase)在DNA复制和细胞分裂中起着重要作用,很可能是鸦胆子油乳细胞内的靶点。本研究将观察鸦胆子油乳对耐药细胞增殖生长的抑制、与其他抗癌剂的协同作用以及对DNA拓扑异构酶活性的影响，为拓展鸦胆子油乳的临床应用提供实验依据。
　

材料与方法

1.1：鸦胆子油乳注射液由沈阳药科大学制药厂提供，每支10ml, 批号：980324，4℃冰箱保存，使用时用双蒸水稀释；四甲基偶氮唑盐（MTT）为Sigma产品；负超螺旋pBR322、氯化高铁血红素购自华美生物工程公司；Brain Heart Infusion(BHI)为DIFCO Laboratories 产品;其余试剂均采用分析级。

1.2 鸦胆子油乳对耐药细胞增殖生长的作用：MKN－28人高分化性胃腺癌耐VCR1.0mg/ml细胞株(N28/VCR1.0), MKN－45人低分化性胃腺癌耐VCR1.0mg/ml细胞株(N45/VCR1.0),SGC7901人中分化性胃腺癌耐VCR0.5mg/ml(SGC7901/VCR0.5)细胞株传代于含10%小牛血清的RPMI1640培养液,于37℃培养于二氧化碳培养箱内（5％CO2/95%空气）.鸦胆子油乳对耐药细胞增殖生长的作用采用MTT法检测，简述如下：细胞种于96孔板中，贴壁24小时，加入受试药物,继续培养72小时后加入20ml 5mg/ml的MTT，37℃温育4小时，加入100ml三联液（10％SDS－5％异丙醇－12mMHCl），温育12－20小时，用平板读数计在570nm处测定每孔的光密度值（OD值）.细胞增殖生长抑制率和增效率分别按公式计算。

1.3 kDNA的提取：锥虫（trypansome）由Toshiwo Andoh教授所赠,培养于含氯化高铁血红素20mg/ml 的BHI 2－3天后收获，裂解,然后用氯化铯－溴化乙锭不连续梯度离心纯化kDNA,最后用乙醇沉淀、TE溶解，分装于－20℃保存。
　
1.4 拓扑异构酶的提取: 按照Isabella等的方法4改进,简要步骤如下:取接种6-7天的艾氏腹水癌细胞约3′107, 悬浮于10ml PBS缓冲液, 以500rpm 离心10min, 洗去血细胞; 将细胞悬浮于1ml nuclear buffer（100mM NaCl, 1mM KH2PO4, 5mM MgCl2, 1mM EGTA, 10mM 巯基乙醇,10% 甘油, 0.5mM PMSF, 0.25M 蔗糖, pH 6.4),然后加入9ml含0.35% Triton X-100 的nuclear buffer,冰浴30 min,1000rpm 离心10min,再用nuclear buffer 洗一次,将核重新悬浮于1ml lysis buffer （100mM NaCl, 5mM KH2PO4,0.5mM EGTA,10mM 巯基乙醇, 0.5mM PMSF, 1mM EDTA)缓慢加入5M NaCl,使其终浓度为0.35M,冰浴1hr,并不时轻轻摇晃,15000rpm 离心15min, 取上清,并加入等体积的甘油，分装存于－20℃。最后，用考马氏亮蓝染色法测蛋白含量.此酶提取液为粗酶，同时含有TOPOⅠ和TOPOⅡ的活性。

1.5 TOPOI介导的DNA解旋作用5: 反应体系为10ml：2.5m l解旋缓冲液（Tris.Cl 200mM,pH7.5, KCl 340mM, MgCl2 40mM, DTT 20mM, BSA 120mg/mg,EDTA 5mM）,0.1mg pBR322,1u酶粗提液及不同浓度的药物，双蒸水补足至10ml。37℃ 温育15min后，加入1ml终止液（100Mm EDTA, O.5％SDS，50% 甘油，0.05%溴酚蓝），在TBE中1％琼脂糖电泳1.5hr,电压控制在4-6V/cm。

    电泳结束后, 0.5mg/ml溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB)染色30min,300nM投射紫外光观察,并用GDS8000凝胶图象分析系统拍照、分析。

1.6 TOPOⅡ介导的kDNA去连环作用6: 反应体系为10ml: 50mM Tris.Cl, pH7.7, 50mM KCl,10mM MgCl2, 1mM ATP, 0.5mM DTT, 0.5mM EDTA, 50mg/ml BSA, 0.2mgkDNA,1u 酶液及不同浓度的药物。于37℃温育15min，加入1ml终止液（5% SDS,5%甘油,0.5%溴酚蓝）终止反应，于0.9%琼脂糖电泳1hr,电压为50V， 0.5mg/ml EB中染色30min，300nm投射紫外光下观察,并用
GDS8000凝胶图象分析系统拍照、分析。

1.7 鸦胆子油乳对DNA的直接作用: 反应体系为10ml: 10mM Tris.Cl,pH7.7, 0.1mg pBR322, 不同浓度的药物。于37℃温育30min, 加入2 ml上样缓冲液。电泳，观察，拍照同上。
　
2 结果

2.1 鸦胆子油乳对胃癌细胞耐药性有有明显的逆转作用。MTT细胞毒实验表明，当鸦胆子油乳浓度为1/4000(体积比)时，对N28/VCR、N45/VCR、7901/VCR的抑制率分别为46.72%、31. 72％和28.54％。鸦胆子油乳与其他化疗药物同时作用时，显著提高了其他化疗剂的细胞毒作用，如表1所示，提示鸦胆子油乳与其他抗癌剂有较好的协同作用，对这三株细胞的耐药性有良好的逆转作用。

2.2 鸦胆子油乳对TOPO I的作用。TOPO I能催化DNA产生暂时的单链断裂，使另一单链从缺口处穿过，从而使超螺旋的DNA（Supercoiled DNA, SC DNA）松弛，解除螺旋。鸦胆子油乳对TOPOI介导的负超螺旋pBR322解旋作用的影响见图1，泳道一为负超螺旋pBR322对照，泳道2为1uTOPO I酶液与SC pBR322于37℃反应15分钟后，SC DNA完全松弛为解旋的DNA（Relaxed DNA,RLX），当反应体系中存在50mM羟基喜树碱-一种已知的TOPO I抑制剂时,TOPO I介导的解旋作受到用完全抑制（泳道3）；泳道4－8为反应体系中加入了不同浓度的鸦胆子油乳，TOPO I的活力未受到影响。

2.3 鸦胆子油乳对TOPO II介导的kDNA去连环作用的影响。KDNA(kinetoplast DNA) 是由成千上万个相互交联DNA小环组成的巨大网状结构，当一个DNA小环从这个网状结构解脱出来时，就需要DNA 形成一个移过性的双链断裂。TOPO II 的催化特点之一是使DNA 发生双链断裂，因此对kDNA 的去连环作用是TOPO II 的特异性反应之一。鸦胆子油乳对TOPO II介导的kDNA去连环作用的影响见图2a和2b，泳道1 为kDNA对照，其余泳道加入了1u TOPO II 粗提液反应;在不加药的情况下，TOPO II的去连环作用产生DNA 小环(minicircle),当反应体系中加入阳性对照50mM VP16时（泳道3），DNA小环大部分消失，表明VP16抑制了TOPOII的活性。泳道4－8为不同浓度的鸦胆子油乳，在鸦胆子油乳浓度为1/320时即可见TOPOII介导的kDNA去连环作用受到抑制,这种作用随着鸦胆子油乳浓度的升高逐渐增强，到浓度为1/40时，DNA小环完全消失,表明在此浓度下鸦胆子油乳完全抑制了TOPO II的活性。

2.4 鸦胆子油乳对DNA的直接作用。如图3所示，在鸦胆子油乳存在的情况下，缺口状没有增加，线状DNA也未出现。但随鸦胆子油乳浓度的增加，pBR322超螺旋有所减少,可能是高浓度鸦胆子油乳使DNA部分变性而滞留在加样槽中所致。

3. 讨论

    肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药性（MDR）是造成肿瘤化疗失败的主要原因, P糖蛋白（Pgp）高表达是产生MDR的主要机制。Pgp是一种能量依赖性"药泵",定位在细胞膜上，能将细胞内药物泵出胞外，使胞内药物浓度下降，降低对肿瘤细胞的毒性，由此产生耐药性9.逆转细胞的耐药性是肿瘤化疗中亟待解决的问题。鸦胆子油乳上广泛应用的的主要成分为油酸、亚油酸、硬脂酸、软脂酸及花生烯酸, 研究表明，鸦胆子油乳与肿瘤细胞膜有特异的亲和力。

    我们设想鸦胆子油乳易穿过细胞膜到达细胞内，可被Pgp识别并与其作用，来竞争Pgp对其他化疗药物的结合位点，抑制药物泵出，从而达到逆转耐药的目的。鸦胆子油乳对N28/VCR、N45/VCR、7901/VCR三个耐药细胞株有较好的抑制其细胞增殖生长的作用, 与ADM、Cis-DDP、MMC、5－FU、VP16具有良好的协同作用，大大增强了这些药物对耐药细胞的细胞毒作用,本研究提示鸦胆子油乳对多药耐药有一定的逆转作用。

   尽管对鸦胆子油乳的抗癌机制已进行了许多研究，但对其细胞内作用靶点仍不甚了解。我们从鸦胆子油乳能抑制DNA生物合成得到启发，检测了其对TOPO酶活性的影响.TOPO酶是一种重要的核酶，能改变DNA的拓扑结构，在DNA复制、转录等过程中起着重要作用10.其中TOPO II是细胞所必需的，在DNA复制、转录、重组中，以及在形成正确的染色体结构、染色体分离、浓缩中发挥重要作用7。由于TOPOⅡ的细胞功能以及其催化特性，成为临床上相当广泛的化学治疗药品的靶点，如具有DNA嵌合能力的抗癌剂m-AMSA、阿霉素、表阿霉素以及非嵌入剂VP-16和Vm26都是TOPOII的抑制剂8。实验结果表明鸦胆子油乳能特异性的抑制TOPOII的活力，而对TOPO I没有影响，对DNA也没有直接作用。这些现象提示TOPO II是鸦胆子油乳细胞内作用靶点之一，在细胞内可能干扰酶的正常功能而导致细胞死亡。TOPOII抑制剂如VP16和ADM等引起的DNA损伤明显下降是MDR耐药细胞株的另一特征11。鸦胆子油乳抑制了细胞内TOPOII的活性，有可能使化疗药物引起的DNA损伤后修复过程受到抑制，也有可能鸦胆子油乳本身能增加TOPOII介导的DNA断裂，增加了DNA损伤累积，从而增强了其他化疗药物的作用。因此，对TOPOII的抑制有可能也是鸦胆子油乳逆转耐药细胞株的机制之一。

    综上所述，本实验研究表明鸦胆子油乳对TOPOII有明显抑制，对胃癌耐药细胞株的增殖生长有较强的抑制，并能显著提高其他抗癌剂对耐药细胞的杀伤。


参考文献

1． 苏兴仁,等.鸦胆子抗肿瘤的研究 7.鸦胆子油静脉乳抗癌作用的实验研究，沈阳药学院学报，1979（10）：15－22
2． 何毅民.临床药学资料1987（1）:1－3
3． Klohs Wdand Steinkampt KW, Mol Pharmacol, 1988;34:180-185
4． De Isabella P, Capranico G, Binashi M, Tinelli S, Zunino F. Mol Pharmacol. 1990; 37:11-16
5． Neil Osheroff, Earl RS, Douglas LB. J Bio Chem. 1983;258: 9536-9543
6． Kazushi Tanabe, Yoji I, Ryoji I, Cancer Res. 1991; 51: 4903-4908
7． Wang JC. DNA Topoisomerases. Annu Rev Biochem. 1996;65: 635-92
8． Pommier Yves , Mark RF, Francois G. Bruce AC, Dan LL, Cancer therapy and
biotherapy (2nd edition). Philadelphia: Lippincott-raven Publishers. 1996:435-458
9．Goldstein LJ, Current Problems in Cancer, 1995, (2):70
10．Liu leroy F. Annu Rev Biochem. 1989; 58: 351-75
11．Deffie AM, Batra JK and Goldenberg GZ, Cancer Res 49:58-62

鸦胆子抗癌----从分子生物学水平探讨鸦胆子抗癌机理

吴松昌

    鸦胆子源于苦木科植物，产于我国的广东，海南，广西，福建等地。古代我国民间广泛用于治疗阿米巴痢疾。从五十年代起有人通过鸦胆子的外用来治疗皮肤乳头状瘤和寻常疣等。

    基于后者提示，1972年报道了应用于治疗宫颈癌获得成功。随之开始了鸦胆子抗肿瘤作用近十几年的研究。

    鸦胆子水溶液是有毒性的，而油脂部分是无毒的[1]。 近十几年的研究注重于油脂部分。而最近的国外研究证实了鸦胆子的水溶液同样也有很强的抗肿瘤作用；若进一步开发研究可望发现一种有效的细胞毒性药物。自八十年代初期，在已故苏守元教授的带领下由沈阳药学院与中国医科大学合作在鸦胆子油脂部分的治疗作用上进行了大量的研究，涉及到全国各地
数以万计的病例及并做了大量的基础实验及临床研究，发表了四百余篇学术论文，对鸦胆子形成了比较完整的认识。

基础研究结果主要有以下几个特点：

1． 对艾氏腹水癌、Luis肺癌及S180等体内外抑瘤试验中都显示其疗效[2]；
2． 体内分布以内皮网状系统及肺部，脑内为浓度最高[3]；
3． 能提高机体的免疫能力；对肿瘤细胞有靶向性。

在临床应用中所观察到的特点是：

1． 抗癌谱广，对肺癌、转性性脑瘤、肝癌、乳腺癌等均显示了一定的抗肿瘤作用，尤其在控制胸腹水方面显示出很强的疗效[4]；
2． 除静脉炎以外几乎没有任何全身性的毒副反应；
3． 能透过血脑屏障[5]，并能使颅内压下降；
4． 治疗效果似乎与鸦乳药物用量有正相关作用。

    由于80年代初期抗癌药种类较少，对鸦乳抗癌作用机理认识仅局限于细胞生物学水平，鸦胆子曾成为一个很受重视的单纯的抗癌药物。但造成了应用未能更深入与广泛。又由于鸦胆子抗癌的细胞毒性效果低于化疗药物，单位治疗用量过大等也是使之未能成为治疗肿瘤的首选药物的原因，所以既往实验及临床研究无论从方法和结果已不能满足目前发展的要求。
随着肿瘤基础研究的深入，分子生物学的建立，尤其是对不饱和脂肪酸的深入认识，使得鸦胆子又重新获得了更广阔的研究及应用空间。

    早在1921年就有学者发现一些二元羟酸有溶解肿瘤细胞的作用，之后国内外对脂肪酸抗肿瘤作用进行了较多的研究。从研究结果来看，碳链越长，解离度越低，呈现分子状态所需的Ph越接近生理Ph[6],则其抗肿瘤活性越明显。而不饱和脂肪酸较饱和脂肪酸的抗肿瘤活性更为明显[7]， 二者间存在显著性差异。同时脂肪酸经甲酯化后其抑瘤性也大大降低，因此
游离羟基和双键是脂肪酸分子中二个重要活性基因。

    油酸和亚油酸均为不饱和脂肪酸，它们的抑瘤活性均已被证实。鸦胆子油乳中的主要活性成分即为油酸和亚油酸，其在油中含量分别占到5%－6％和 2％.鸦乳的抑瘤活性亦已经被实验和临床证实，但其作用机理的报道甚少，仅见其为抑制 DNA合成的抗癌剂的报道。究竟
其如何抑制DNA合成的则未见报道。
　　另外，目前研究已表明。鸦胆子中的脂肪酸可直接结合到肿瘤细胞膜上，使细胞膜的脂肪酸组成发生明显改变[7] 。而细胞膜流动性的维持主要靠膜中胆固醇水平和脂肪酸不饱和度来调节。肿瘤细胞和脂肪酸修饰对脂肪酸组成的影响大，对胆固醇含量几乎无影响[8]。

    因此细胞膜通透性的改变使通过膜中脂肪酸组成改变而改变，特别是膜中磷脂的脂肪酸组成而实现，其不饱和度越大，膜流动性也越大[9].通过电镜观察鸦胆子中的油酸对肿瘤细胞的作用主要是破坏生物膜结构，大剂量时可使癌细胞完全崩解[10]。

    从目前研究现状来看，鸦胆子脂肪酸对于肿瘤细胞膜上的作用研究报道较多，但均局限于细胞水平的分析研究，而其对肿瘤细胞基因调控的影响乃至耐药癌细胞胞膜通透性的影响都未有研究。而针对性的鸦胆子油乳作用机制方面的研究则未见有任何报道。另外从国内的报道来看鸦胆子油乳的油酸组成具有阻断ＤＮＡ合成的作用，但究竟作用在哪一环节上尚未
作任何研究。因此鸦乳的具体作用机制尚属空白。

    由于癌症研究的不断进步，在分子生物学水平也有了长足的发展。如PER受体，P53段基因，拓扑异构酶，nm23, P170，端裂酶，细胞凋亡等与鸦胆子的关系，都将有待于进一步认识，从而丰富鸦胆子的研究内涵，而这些研究与临床应用和药剂型的改变又是紧密相关。1998至1999年由中科院上海药物研究所肿瘤课题组对鸦胆子进行了两项研究。其中一项结果表明，鸦乳对拓扑构酶Ⅱ有很强的抑制作用。另一项实验结果表明，鸦乳与ADM,DDP,MMC,5-Fu等药物协同可对已耐药的肿瘤细胞株再次起到抑瘤作用。这两项实验研究，再次激起研究者的兴趣。最近的临床观察也告诉我们，评价鸦乳这类肿瘤临床的疗效，不能单纯只看瘤径的变化，更要看肿瘤患者带瘤生存的时间和质量。由于不饱和脂肪酸的作用环节有异于细胞毒性药物，故建立新的观察指标和新的研究方法是目前鸦乳研究需要解决的问题，而这些研究也给了临床工作者提供了改变鸦乳观察角度的方法。


参考文献

1．刘寿山.　 中医研究文献摘要　科学出版社　1975：525
2．苏兴仁,等. 沈阳药学院　1979;11:15
3．苏兴仁,等. 中草药　1981;12(4):21
4．苏守元. 中药－鸦胆子乳剂的基础研究和临床应用 1991:10
5．孙汉功,等. 鸦胆子乳剂治疗脑肿瘤引起的超微结构的研究.肿瘤防治研究1995;22(2)85
6. Morgan JF et al Can J Biochem Physiol 1960;38:597
7. 朱友平.脂肪酸的抗肿瘤作用.国外医学肿瘤分册1990;3:133
8. Yoo T-J, et al Cancer Res 1980;40:1084
9. Dickens BF, et al Biochemistry 1982;21:3304
10.扬志博,等.　 沈阳药学院学报　1986;3:1