二、临床应用

    尽管未得到FDA的批准，检测病毒RNA的RT-PCR已被临床广泛采用。检测HCV RNA的PCR技术主要用于：（1）急性丙肝感染的诊断（在抗-HCV出现以前）；（2）丙肝抗体假阳性或假阴性病人的确诊；（3）鉴别自限性或持续性HCV感染；（4）观察治疗反应。

    PCR法检测HBV DNA主要用于：（1）不典型血清学表现病人的确诊；（2）观察治疗反应。

    在暴露HCV（如针刺伤）以后，丙肝抗体出现以前，急性HCV感染的诊断极其重要。现行的血库筛查包括献血员筛选、抗原抗体筛查及血制品生产过程中病毒灭活程序，已大大减少了HBV与HCV传播的危险性到1：180000与1：130000献血员。在血清学阴性的窗口期的献血员引起输血后HCV与HBV感染的主要原因。HCV RNA在暴露后1~3周即可检测到，而丙肝抗体出现的时间平均为8~9周，最长可达9月。最近，NAT检测HCV、HBV与HIV已被引入血制品筛查程序。NAT检测预期可将HCV的窗口期减少59天，而HBV减少25天。在血库所采用的NAT标准程序将为NAT在其他临床检测领域的标准化奠定基础。

（一） HCV RNA的检测

    在几种特殊临床情况下为了确定HCV感染，直接检测HCV RNA是必需的。这是由于抗-HCV的测定结果不可靠或机体免疫力缺陷。现有的HCV（EIA-3）血清学筛查试剂盒具有极高的敏感性（95%），但假阳性时有发生，特别是在低危人群如义务献血员。RIBA2和RIBA3有助于解决EIA假阳性结果的问题。90%以上的EIA阳性肝病患者用PCR检测HCV RNA阳性，提示PCR法比RIBA在诊断HCV感染方面更为准确。核酸检测有助于判断RIBA法难以确定的抗体结果，排除低危人群中假阳性结果。此外，在有免疫抑制或缺陷病人（如器官移植、血透析病人等）NAT对HCV感染的诊断价值要优于抗体检测。

    前瞻性研究显示抗-HCV阳性的献血员中有15~25%HCV感染为自限性，表现为转氨酶的复常与HCV RNA 的持续阴转。NAT是区别自限性感染与持续性感染的唯一有效手段。通常需要多次反复测试才能确定感染是否已清除。由于技术方面的原因或血标本的处理不当使PCR敏感性下降或由于病毒血症呈间歇性，因此，单一次PCR可能呈假阴性结果。因此不能单凭一次阴性PCR结果来确定感染是否已痊愈，而应反复多次测试。

    HCV RNA的检测是评价治疗反应的重要手段。生化与病毒学反应常不一致。在临床实践中，抗病毒结束时采用PCR检测HCV RNA以观察治疗反应。转氨酶正常但HCV RNA持续阳性很可能在疗程终止后复发。对有治疗反应（HCV RNA 阴转）者，应在治疗结束后6~12个月多次检测HCV RNA以监测持续反应。治疗结束后6~12个月HCV RNA持续阴性预示着HCV RNA将长期保持阴性和肝功能正常。在评估HCV RNA清除方面，应采用最敏感的方法，定性法比定量法要优。

（二） HBVDNA的检测

    一般来说，HBV血清标志物，特别是表面抗原和e抗原能准确反映传染性存在。用PCR法检测HBV DNA较少用于诊断。在献血员如排除了肠道外暴露因素，如出现单次抗-HBc阳性，尤其是EIA法 OD值较低时可能属于假阳性。在HBV感染的高危人群，单项抗-HBc阳性常表示过去感染或临床症状轻微的底水平HBV 感染。用PCR法检测HBV DNA可用于不典型血清学表现慢性肝病患者的鉴别诊断，以排除HBV 感染。用PCR法可从无任何HBV 感染标志物的患者血清和肝组织上检测到HBV DNA。

    乙肝抗病毒治疗的疗效包括HBV复制水平下降、e抗原/e抗体血清学转换、定量PCR法HBV DNA持续阴转。在取得完全治疗反应者有表面抗原阴转、表面抗体阳转，但肝组织中低水平HBV DNA常持续数年之久。其临床意义尚不清楚。

三、展望

    NAT将逐步标准化。HCV RNA的检测将在临床常规应用。NAT的适用范围包括血液、组织及器官筛先及针刺与其他皮下暴露者的随访。暴露后感染的早期发现有利早期抗病毒治疗，减少慢性化的机会。NAT用于传染性的评估、不典型血清学表现病人及肝功能正常、抗体阳性病人的诊断与抗病毒治疗的疗效判断。通过检测PBMC与肝组织中病毒基因来判断康复型或持续性感染。

一、HCV定量检测

    HCV定量检测的方法很多，主要分为以下两类：?靶基因扩增；?信号扩增。前者包括Roche生产的Amplicor HCV Monitor系统与Organon生产的NASBA HCV定量系统。HCV RNA靶序列经逆转录与PCR 扩增后，再通过参照系统来确定靶基因的相对含量。后者包括Branched DNA法（HCV Quantiplex 2.0, Bayer），该法采用信号扩增法而不是扩增靶基因。它以HCV 5’UTR与C区基因片段作捕获探针与靶探针，通过人工合成的标记分枝DNA寡核苷酸来扩增被捕获的HCV RNA。再经化学发光法作定量测定。

    Amplicor HCV Monitor、HCV Quantiplex 2.0与HCV NASBA是目前应用最广泛的三种HCV定量系统，由于每种定量系统使用的标准不同，故相互之间缺乏可比性。迄今尚没有一种定量法得到FDA批准。
判断定量PCR法敏感性的指标之一是比较不同人群HCV的阳性率。在慢性HCV感染者，用Amplicor HCV Monitor检测，阳性率为78%~100%，Quantiplex为79%~100%。在另一项比较研究中，NASBA 、HCV Quantiplex 、Amplicor HCV对慢性HCV病人的敏感性分别为99%、94%与88%。在ALT正常的丙肝病人其敏感性分别为66%、46%、66%，而一般RT-PCR阳性率为53%~66%。

二、HBV定量检测

    HBV DNA的定量检测技术大体上可分为杂交定量（Genostics Assay、Digene Diagnostics）、分枝DNA技术（HBV Quantiplex, Bayer ）与靶基因扩增（HBV Amplicor，Roche）。

    在HBsAg阳性的乙肝病人，采用 HBV Quantiplex技术检测HBV DNA，其阳性率在HBeAg阳性者为73%~100%，在HBeAg阴性者为25%~31%，而 Genostics assay分别为67%与13%。Genostics与Quantiplex技术的敏感性比PCR分别低10，000和1000倍。HBV Amplicor与Digene的敏感性分别为103拷贝/ml与106~107拷贝/ml。

    在HBeAg阳性病人，上述各种定量技术检测HBV DNA阳性率相似，但对HBeAg阴性或接受抗病毒治疗病人，HBV Amplicor的敏感性比Quantiplex或杂交法更为敏感。


三、酸定量技术的应用


    核酸定量技术可用于判断感染的存在与否，但由于其敏感性较定性PCR低，故定量法阴性时，应采用定性PCR进一步确定。因此，当临床上判断感染是否存在或持续时，定性PCR法是“金标准”。

（一）HCV感染

    HCV载量的测定有助于了解HCV感染自然过程与病理改变。前瞻性研究表明，在未作抗病毒治疗的病人经3个月~6.6年的随访，其HCV RNA水平是相对恒定的（波动范围1.3Log）。在ALT正常的病人，随访10+2月HCV RNA水平高低相差0.7Log，在ALT有波动者为1.3Log。一般来说，病毒载量与ALT之间关系不大。病毒载量与组织学病变严重程度之间关系的研究结果不一致，但多数认为两者间不相关。HCV RNA滴度与远期预后如肝硬化或肝癌之间关系尚未明了。但高水平HCV RNA的HCV感染者其起病急、潜伏期短，出现黄疸较多见。

    定量分析法在抗病毒疗效判断中具有重要价值。治疗前病毒载量是预测干扰素近期疗效与远期疗效的重要指标。有研究显示，病毒载量小于100万拷贝/ml者对干扰素持续应答率为50.5%，而大于100万拷贝/ml者为17.3%。在干扰素与Ribavirin联合治疗时，大于或小于200万拷贝/ ml为持续应答的预测指标。

    在干扰素治疗时，HCV RNA水平的早期下降，比治疗前HCV RNA水平更能有效预测持续反应。在单用IFN治疗者，治疗开始实4周HCV RNA水平下降超过3 Log者，比HCV基因型及治疗前水平更能准确预测到持续反应。有研究显示，持续反应者在治疗2周HCV RNA转阴率为48%，（<100拷贝/ ml），在4周、6周与12周阴转率分别为78%、81%与96%。病毒定量也可用于确定传染性的大小，如HCV的母婴传播与母亲高滴度HCV（>100万拷贝/ml）水平有关。

（三） HBV

    有病毒活动性复制的慢性HBV携带者，其发展为进展性肝病的危险性较高。HBV DNA定量测定比HBV血清学标志更能有效反应病毒复制与否，特别是前C区变异株感染者。前C区变异者常有较高水平的病毒血症，其e抗体阳性，可能引起严重肝脏病变。

    治疗前病毒水平可作为干扰素治疗反应的预测指标。HBV DNA水平低于200ng/ml（液相杂交）者干扰素疗效比高于200ng/ml者要好。HBV DNA滴度高者用拉米夫定治疗也往往无效，在过程中HBV DNA滴度先降后生者常提示HBV对拉米夫定抗药性的出现而失效。

病毒变异的检测

一、 HCV基因分型

    HCV高度变异，至少有七个基因型和许多基因亚型，HCV的基因变异对HCV感染者的诊断、病理、治疗及疫苗研究均具有重要实际意义。HCV基因分型的方法有PCR产物杂交法、分型引物RT-RFLP法、血清学方法（Immunoblot）及测序法等六种方法。他们检测分型结果之间总的吻合率约为94%。

    有研究显示1b型HCV感染者病情较重，并与肝硬化及 HCV 相关性肝癌相关，提示1b型致病性较强。

    HCV基因型与干扰素或干扰素/ribavirin疗效相关。1型持续反应率明显低于2型和3型。对1型病人疗程48周比24周疗效好，病毒滴度<200万拷贝/ml者疗效比>200万拷贝/ml者好。提示对基因2、3型HCV感染干扰素疗程以24周为宜，而1型则需48周。


二、 HCV基因序列分析


    HCV基因序列测定可用于了解NS5A（aa2209~2248）的干扰素敏感性决定区（ISDR）中aa 2209~2248的变异情况，预测干扰素的治疗反应。基因测序还可用于HCV感染的分子流行病学调查等。


三、 HBV基因分型与测序


    HBV可分为6个基因型（A-F），各型间aa序列相差8%。不同基因型HBV其地区分布不同，其临床意义尚未明了。但对HBV感染的血清学诊断可能有重要意义。

    HBV基因的某些区域变异具有重点临床意义。如前C区与C区变异可能与病情加重有关，S基因的a抗原决定簇变异株HBV可再感染乙肝表面抗体阳性人群。在拉米夫定与Famciclovir变异过程中因P基因发生变异（YMDD）而耐药。

基因芯片在肝炎病毒检测中的应用

一、 基因芯片的概念

    基因芯片是采用光刻合成或高速打印技术在硅片、玻片或尼龙膜上，按照特定的排列方式固定上大量的探针，形成一种DNA微矩阵，将样品DNA或RNA通过PCR或RT－PCR扩增、体外转录等技术并掺入标记分子后，与位于芯片上的探针杂交，通过同位素法、化学发光法、化学荧光法或EIA法显示，经高分辨率扫描仪扫描后，利用计算机进行综合分析，获得样品中大量基因序列及表达的信息。基因芯片是一种先进的快速高效大规模、高通量的检测技术。

    基因芯片的生物学原理并不复杂，就是根据遗传学中心法则，利用基因互补配对原则，在同一载体上同时进行多基因检测。简单的说就是高密度的斑点杂交技术。


二、基因芯片与传统膜杂交比较，其主要优点有：

1、微矩阵芯片点样密度远远高于膜的点样密度；
2、 微矩阵芯片可用双色荧光标记两种探针，这样数据准确度大大提高；而膜杂交通常只能用一种探针，数据可比性差；
3、微矩阵杂交体积小，只需20ul左右，灵敏度高，膜杂交体积2ml灵敏度差；
4、微矩阵芯片操作易于自动化（点样、杂交、图像处理、数据收集）。


三、应用


    诊断性基因芯片可用于肝炎及其变异株的研究。不仅可以同时检测多种肝炎病毒及其变异株、亚型，且检测的的突变株可涵盖HBV与HCV等几乎所有常见突变位点。可采用基因芯篇对不同种类肝炎病毒（HBV、HCV、HGV、HAV、CMV等）进行同时检测，并可一次检测获得结果；对单核苷酸多态性（SNP）基因分型研究（含对亚型和变异株进行筛查检测），亦可一次检出结果。目前已用于肝炎病毒的分型或变异。对HBV的YMDD变异分析检测。


四、目前基因芯片技术存在的问题


1、 假阳性率偏高；
2、 需要首先对检测标本进行PCR扩增；
3、 重复性、平等性、不同芯片的集成化和检测灵敏度等问题待解决。